再添新作！天昊生物助力南京農(nóng)大發(fā)表不同施肥制度對單作土壤微生物影響新成果

發(fā)稿時間：2017-05-25來源：天昊生物

 南京農(nóng)業(yè)大學陳巍教授課題組近期在《Plant Soil》上發(fā)表了富含木霉的有機肥可以減輕單作土壤微生物惡化從而更好地維持植物生長的文章。在恭喜天昊生物客戶又發(fā)表微生物文章同時，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目：Trichoderma-enriched organic fertilizer can mitigate microbiome degeneration of monocropped soil to maintain better plant growth

中文題目：富含木霉的有機肥可以減輕單作土壤的微生物惡化從而更好地維持植物生長

期刊名：Plant Soil      發(fā)表時間： 2017年    影響因子： 3.11

研究目的: 研究不同施肥制度驅動下土壤微生物的轉變將有助于減輕農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中單一栽培的負面影響。

材料方法:

富含木霉有機肥準備及盆栽試驗描述

把（豬糞：菜籽粕=1:1, w/w）和哈茨木霉SQR-T037孢子懸浮液按比例(100:1, w/v)制成混合有機肥，然后有氧發(fā)酵7天。為了調(diào)查三種不同施肥方式對單作系統(tǒng)土壤微生物的影響，在溫室中通過重復施肥連續(xù)進行5次番茄盆栽實驗。三種不同施肥方式分別是：1）CF：100%化肥；2）BF：75%化肥+富含木霉有機肥；3）：OF: 75%化肥+混合有機肥（不含木霉）。每種施肥方式使用6盆，每盆有2株番茄。

根際土壤采樣與DNA提取

番茄連續(xù)種植第五個生長季后，從每個盆里收集土壤樣品。使用PowerSoil DNA Isolation Kit (MoBio)提取18份土壤樣品中的總DNA。測定土壤化學性質(zhì)，包括土壤有機質(zhì)（OM），可用氮、可用磷、可用鉀、總氮、總磷、總鉀。

Real-time PCR檢測土壤細菌和真菌含量

使用Real-time PCR量化土壤細菌和真菌數(shù)量，細菌引物：338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) 和518R (5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)。真菌引物：ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) 和 5.8S (5′-CGCTGCGTTCTTCATCG-3′)。將16S和ITS片段克隆到pMD 19-T載體，然后此重組載體作為標準質(zhì)粒。

Miseq測序

細菌測序區(qū)段為：（V3，V4）；真菌測序區(qū)段為：（ITS2）。

三種施肥制度下的植物生長測定

為了分析三種施肥制度對下一茬作物生長的影響，在溫室下進行了另外的盆栽試驗。番茄單一輪作5次后，每個盆收集300g土壤，然后轉移到一個新的含有21天大小番茄的盆中，生長4周后，使用Minolta SPAD-502測定最新生長的兩片完整葉的葉綠素。同時測定幼苗的生物量和根系生長狀況。

研究結果：

土壤養(yǎng)分特性

三種不同施肥制度連續(xù)處理五次后，土壤營養(yǎng)特性差異巨大，所有測試的土壤營養(yǎng)成分，包括有機質(zhì)（OM）、銨態(tài)氮、可用磷、可用鉀、總氮、總磷、總鉀在BF和OF組相對于CF組（全化肥）是明顯增高的，除了硝態(tài)氮。同時，相對于OF組（普通有機肥），從BF組收集的土壤有顯著較高的有機質(zhì)（OM），速效磷，速效鉀，總氮。

表1 不同施肥制度對土壤特性的影響

細菌和真菌種群

qPCR檢測結果（圖1）表明，BF處理的土壤具有最多的細菌種群，其次是OF處理過的土壤， CF處理的土壤細菌種群數(shù)量最少。然而，三種不同施肥處理土壤的真菌種群之間則沒有明顯的差異。

        

圖1  Real-time PCR檢測土壤細菌和真菌含量

細菌和真菌α多樣

所有樣品的coverage指數(shù)為0.99，表明測序能力足夠，能捕捉每個土壤樣品的完整多樣性（表2）。指數(shù)Chao1表明BF處理土壤細菌和真菌群落OTU個數(shù)比CF組和OF組多。此外，BF處理土壤具有最高的細菌Shannon指數(shù)，CF 處理組和OF 處理組分別具有最低的細菌Shannon指數(shù)和真菌Shannon指數(shù)。

表2 不同土壤樣品的豐富度、多樣性和蓋度度統(tǒng)計

土壤細菌和真菌群落組成

每個土壤樣本平均得到89494條序列，如圖2所示，雖然不同土壤樣品細菌和真菌群落門水平組成相似，但是三種不同施肥處理土壤門水平分布是有差異的。所有樣品優(yōu)勢細菌門是放線菌門、變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門（圖2A），優(yōu)勢真菌門則是子囊菌門和擔子菌門（圖2B）。放線菌門占CF組細菌群落的53%，但是在BF和 OF組分別占39%和42%。相反的是，厚壁菌門在BF組、OF組、CF組分別占10%、10%、5%。變形菌門在BF組和OF組相對于CF組更豐富。至于真菌群落，在CF處理組中，球囊菌門和接合菌門的豐度要比BF 組和OF組高，而相對于其它兩組，BF組則有豐度最高的壺菌門。

圖2 所有土壤樣品主要細菌門（a）和真菌門（b）的相對豐度（%）。

植物生長測定

通過測量葉綠素含量、株高、干重和根系（表3；圖S3）來評定三種類型單作土壤對植物生長的影響。生長在BF處理的土壤上的番茄幼苗有最高的株高、生物量和葉綠素含量，其次是生長在OF處理土壤上的番茄幼苗。與此相反，CF處理組的幼苗有著顯著降低的高度、生物量和葉綠素含量（與BF組相比，分別下降了75%，54%和89%）。相對于CF組， BF和OF組的番茄幼苗根部發(fā)育更加良好，例如總根長、表面積和平均直徑。此外，BF處理組的根表面積和平均直徑比OF組顯著較高。

表3 三種不同處理土壤番茄幼苗生長及根系發(fā)育測定

土壤微生物、土壤化學性質(zhì)和植物生長之間的關系

基于微生物門水平、土壤化學性質(zhì)和植物生物量數(shù)據(jù)的RDA分析結果表明， 第一成分（RDA1）可以把CF組和其它兩組（BF和OF）分開，而第二成分（RDA2）則不能區(qū)分開這三組。如RDA分析（圖3）和Spearman’s相關性結果（表4）所示，酸桿菌門、厚壁菌門和變形菌門與大部分的土壤營養(yǎng)特性正相關，同時與土壤硝態(tài)氮呈負相關。相反的是，放線菌門和接合菌門與土壤硝態(tài)氮正相關，而與速效鉀、總磷、總鉀呈負相關。土壤總磷與芽單胞菌門正相關，與球囊菌門和接合菌門呈負相關。壺菌門和土壤有機質(zhì)（OM），總氮呈正相關。另外，BF組較高的植物生長率與酸桿菌和變形桿菌的豐度呈正相關，大部分土壤性質(zhì)除硝態(tài)氮之外，與放線菌呈負相關。

       

圖3微生物群落、環(huán)境變量和植物生物量之間的RDA分析

表4 植物營養(yǎng)成分與綱水平不同微生物之間的Spearman’s相關性分析

總結：

l  CF（100%化肥）處理組土壤導致細菌多樣性最低，而BF（75%化肥+富含木霉有機肥）處理組土壤的細菌多樣性水平最高。

l  OF 處理組土壤的真菌多樣性水平最低，而CF和BF處理組土壤的真菌多樣性水平較高。

l  BF處理組土壤的肥力和植物生長狀況最好，OF和CF處理組緊隨其后。

l  與CF 和 OF處理土壤相比，富含木霉有機肥的BF處理是控制單作土壤微生物惡化從而保持番茄植株健康生長的最佳制度。

關于天昊：

      天昊生物采用Miseq PE250測序策略對細菌16S rDNA區(qū)/真菌ITS區(qū)/真菌18S rDNA區(qū)的雙V區(qū)或多種單V區(qū)進行測序，使用低循環(huán)數(shù)擴增，保證每個樣品擴增的循環(huán)數(shù)統(tǒng)一；采用特殊方法可有效避免系統(tǒng)內(nèi)誤差；數(shù)據(jù)質(zhì)量高，有效序列Q30達到80%以上；加上最新升級的分析內(nèi)容和解釋詳盡的結題報告，帶您享受極致的微生物擴增子測序體驗。