天昊客戶新文: 杏鮑菇多糖（PEP）對糞便微生物組成和免疫應(yīng)答影響

發(fā)稿時間：2017-11-09來源：天昊生物

 

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院近期在《Food & Function》上發(fā)表了杏鮑菇多糖（PEP）對糞便微生物組成和免疫應(yīng)答影響的文章。在恭喜天昊生物客戶發(fā)表微生物文章同時，想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目： In vivo fermentation of a Pleurotus eryngii polysaccharide and its effects on fecal microbiota composition and immune response

中文題目：杏鮑菇多糖（PEP）對糞便微生物組成和免疫應(yīng)答影響 

期刊名：Food & Function       影響因子： 3.2469

材料方法:

實驗設(shè)計

所有老鼠都被關(guān)在籠子里，隨機分為四組，每組10只小鼠：（1）PEP低劑量組（LP）：小鼠口服給藥每公斤體重0.2克PEP；（2）PEP中劑量組（MP）：小鼠口服給藥每公斤體重0.4克PEP；（3）PEP高劑量組（HP）：小鼠口服給藥每公斤體重0.8克PEP；（4）對照組（蒸餾水）。所有小鼠口服給予PEP或蒸餾水在實驗周期上午9:00左右灌胃。每只小鼠口服給藥量根據(jù)每天的體重進行調(diào)整。在實驗期6周后，收集小鼠糞便，用于糞便DNA提取。二乙基乙醚麻醉，頸椎脫臼法處死實驗小鼠，在無菌條件下，冷板上縱向解剖獲得內(nèi)容物，每節(jié)內(nèi)容物分成3等份，保存在20?°C用于短鏈脂肪酸濃度、水分含量、pH值測定。

Miseq測序

16S細菌擴增子測序區(qū)段為：（V4）。

材料和化學(xué)品

新鮮杏鮑菇購買自當(dāng)?shù)亍?/span>6種高純度的SCFA（短鏈脂肪酸）（乙酸、丙酸、i-butyric acids、n-butyric acids、i-valeric acids、n-valeric acids）用于標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備。

實驗動物

C57BL／6雄性小鼠（6周齡）體重20± 2克，動物適應(yīng)以下環(huán)境兩周：溫度，25 ± 2 °C；相對濕度，50 ± 5%；12/12小時光暗循環(huán)。整個實驗過程接受標(biāo)準(zhǔn)飲食。

PEP的制備與表征分析

PEP制備是根據(jù)前期研究進行。PEP表征分析，包括純度檢測、均勻性和分子量測定、單糖組成分析、硫酸和糖醛酸含量測定、紫外（UV）光譜和傅里葉變換紅外（FT-IR）光譜分析。

研究結(jié)果：

PEP基本結(jié)構(gòu)

PEP的純度、分子量、單糖組成、硫酸根含量請見表1。在260 nm和280 nm處沒有吸收峰，光譜分析表明PEP中沒有核酸或蛋白質(zhì)存在（圖1a）。PEP的FT-IR光譜在500-4000cm^?1，3399.9 cm^?1位置廣闊的伸展峰代表了羥基基團(–OH)，揭示了PEP多糖鏈較強的分子內(nèi)與分子間相互作用（圖1b）。

表1  PEP的基本特征（純度、分子量、糖醛酸、硫酸及單糖組成）

 

 

圖1   PEP的紫外（UV）光譜和傅里葉變換紅外（FT-IR）光譜

SCFA（短鏈脂肪酸）的測定

對照組和不同劑量PEP口服小鼠的SCFA總濃度如圖2所示：相對于對照組，MP和HP喂養(yǎng)組在盲腸具有顯著較高的SCFA總濃度。相對于盲腸內(nèi)容物，結(jié)腸內(nèi)容物具有顯著較低的SCFA總濃度。隨著PEP劑量增加，盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物中的總SCFA濃度分別從13.41 ± 1.78 mmol L ^?1，5.91 ± 1.23 mmol L^?1增加到22.08 ±1.74 mmol L^?1 ，7.40 ± 1.65mmol L^?1。

 

圖2 對照組和不同劑量PEP口服小鼠結(jié)腸和盲腸內(nèi)容物的SCFA總濃度

相對于對照組，高劑量PEP喂養(yǎng)組（HP）在盲腸具有顯著較高的乙酸濃度（圖3a），然而結(jié)腸在對照組和PEP喂養(yǎng)組無顯著變化。相對于對照組，高劑量PEP喂養(yǎng)組（HP）在盲腸具有顯著較高的丙酸濃度（圖3b），然而結(jié)腸在對照組和PEP喂養(yǎng)組無顯著變化。相對于對照組，高劑量PEP喂養(yǎng)組（HP）在盲腸具有顯著較高的兩種丁酸濃度（圖3c,d）。相對于對照組，高劑量PEP喂養(yǎng)組（HP）在盲腸和結(jié)腸都具有顯著較高的i-valeric濃度（圖3e）。而n-valeric在對照組和PEP喂養(yǎng)組的盲腸無顯著變化（圖3f）。

 

圖3對照組和不同劑量PEP口服小鼠結(jié)腸和盲腸內(nèi)容物的乙酸（A）、丙酸（B）、i-butyric acids (C)、n-butyric acids (D)、i-valeric acids (E)、n-valeric acids (F)。

結(jié)腸和盲腸內(nèi)容物pH值和含水量

口服PEP后，結(jié)腸和盲腸內(nèi)容物的pH值隨著PEP劑量增加而降低（圖4a），這可能是由于胃腸道微生物的PEP發(fā)酵產(chǎn)物所致。口服PEP后，結(jié)腸和盲腸內(nèi)容物的含水量隨著PEP劑量增加而升高（圖4b），這可以歸因于整個實驗期間胃腸道內(nèi)容物PEP強大的持水能力。

 

圖4 對照組和不同劑量PEP口服小鼠結(jié)腸和盲腸內(nèi)容物的pH值（A）和含水量（B）。

糞便微生物組成

口服PEP 會導(dǎo)致糞便豐富度增加。厚壁菌、擬桿菌、變形桿菌是主要的門，相對于對照組，高劑量PEP喂養(yǎng)組厚壁菌門的相對豐度明顯減少，而擬桿菌門明顯增加（圖5a）；綱水平，高劑量PEP喂養(yǎng)組Bacterioidia 和Bacilli的相對豐度增加, Clostridia的相對豐度減少（圖5b）；目水平，高劑量PEP喂養(yǎng)組Bacteroidales和Lactobacillales的相對豐度顯著增加，Clostridiales的相對豐度減少（圖5c）；科水平，高劑量PEP喂養(yǎng)組Porphyromonadaceae，Rikenellaceae，Bacteroidaceae，Lactobacillaceae的相對豐度顯著增加，Lachnospiraceae and Ruminococcaceae的相對豐度減少（圖5d）;

 

圖5對照組和不同劑量PEP口服小鼠糞便菌群在門（A）、綱（B）、目（C）、科（D）水平上的分類。0–1到0–10, 1–1到1–10, 2–1到2–10，3–1到3–10糞便代表對照組，LP組，MP 組，HP組。

小鼠糞便菌群熱圖表明低劑量PEP喂養(yǎng)組和對照組的糞便菌群比較類似，中劑量PEP喂養(yǎng)組和高低劑量PEP喂養(yǎng)組的糞便菌群比較接近（圖6）。

 

圖6 對照組和不同劑量PEP口服小鼠糞便菌群熱圖分析。0–1到0–10, 1–1到1–10, 2–1到2–10，3–1到3–10糞便代表對照組，LP組，MP 組，HP組。

PCoA分析顯示各組間微生物群落具有差異性（圖7）。

圖7對照組和不同劑量PEP口服小鼠糞便菌群PCoA分析。

免疫應(yīng)答分析

在全程灌胃期間，不同組別每星期小鼠體重變化沒有差異，說明不同處理組小鼠的健康狀況相同。脾臟、肝臟和胸腺指數(shù)如下表2所示。相對于對照組，高劑量PEP喂養(yǎng)組胸腺指數(shù)具有非常顯著性差異（p＜0.01），脾臟、肝臟指數(shù)則有顯著性差異（p＜0.05）。

表2  PEP處理對臟器指數(shù)的影響

 

各組血清及腸內(nèi)容物中的免疫細胞因子分泌情況如圖8所示。PEP處理后血清IL-12濃度無顯著變化。然而，相對于對照組，高劑量PEP喂養(yǎng)組的血清TNF-α，IFN-γ，IL-1，IL-2， IL-6和盲腸和結(jié)腸SlgA顯著增加，提示了PEP的免疫功能調(diào)節(jié)作用。

 

圖8  PEP對血清免疫細胞因子（A, TNF-α; B, IFN-γ; C, IL-1; D, IL-2; E, IL-6; F, IL-12）和盲腸(H)和結(jié)腸(I)SlgA的影響，n=10。

總結(jié)：

• 對照組與高劑量PEP喂養(yǎng)組（HP）小鼠盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物的短鏈脂肪酸濃度、pH值和水分含量顯著不同。
• 對照組與PEP處理組的糞便菌群結(jié)構(gòu)有顯著差異， 紫單胞菌科、理研菌科、擬桿菌科、乳桿菌科豐度均在PEP處理組增加。
• 高劑量PEP口服給藥后的免疫反應(yīng)顯著改變。這項探索性研究表明PEP的攝入對胃腸道健康有積極作用。

關(guān)于天昊：

      天昊生物采用Miseq PE250測序策略對細菌16S rDNA區(qū)/真菌ITS區(qū)/真菌18S rDNA區(qū)的雙V區(qū)或多種單V區(qū)進行測序，使用低循環(huán)數(shù)擴增，保證每個樣品擴增的循環(huán)數(shù)統(tǒng)一；采用特殊方法可有效避免系統(tǒng)內(nèi)誤差；數(shù)據(jù)質(zhì)量高，有效序列Q30達到90%以上；加上最新升級的分析內(nèi)容和解釋詳盡的結(jié)題報告，帶您享受極致的微生物擴增子測序體驗。