【昊閱讀】花生種子性狀SSR分子標記關聯(lián)研究

發(fā)稿時間：2018-02-06來源：天昊生物

文章題目：Genetic Variation and Association Mapping of Seed-Related Traits in Cultivated Peanut (Arachis hypogaea L.) Using Single-Locus Simple Sequence Repeat Markers

利用單位點簡單重復序列標記（SSR）進行栽培種花生遺傳變異與種子相關性狀關聯(lián)分析

發(fā)表期刊：Frontiers in Plant Science 發(fā)表時間：2017-12-11 影響因子：4.3

 

摘要一覽：

花生是世界重要的食用油和可消化蛋白質(zhì)來源，其栽培種（Arachis hypogaea L.）是一種異源四倍體（AABB，2n = 4x = 40），它的種子大小和重量是顯著影響花生產(chǎn)量與營養(yǎng)成分的重要農(nóng)藝性狀。然而目前對種子相關性狀的遺傳基礎認識仍然模糊不清。關聯(lián)作圖是快速有效地探索植物重要性狀遺傳基礎的有力途徑。在這項研究中，研究人員利用554個單位點SSR分子標記，對104個花生品種的種子相關性狀進行了關聯(lián)研究。大部分花生品種在檢測組合中與SSR標記沒有或弱相關，連鎖不平衡的衰減在基因組水平大約為1cM的遺傳距離，并且B亞組的LD衰減比A亞組要快。在關聯(lián)分析中四個與種子相關性狀觀察到了很大的表型變異。針對人口結(jié)構(gòu)和親緣關系采用混合線性模型，檢測到不同環(huán)境中與4個種子性狀顯著相關的30個SSR標記（P＜1.81x10^-3），解釋了各種性狀表型變異的11.22-32.30%，其中AHGA44686標記可以解釋多種環(huán)境下的大量表型變異（26.23-32.30%）。與種子性狀相關有利等位基因的關聯(lián)分子標記，以及相關標記等位基因最佳組合的確定，顯著提高了性狀表現(xiàn)，揭示了這些關聯(lián)標記在花生育種中的應用潛力。

 

實驗材料：

中國花生99份核心種質(zhì)和附加的五份品種（Zhonghua 6_vul、Zhonghua 10_vul、Yuanza 9102_vul、ICG6375_vul和ICG12625_aeq）。

 

研究方法：

1、SSR分子標記多態(tài)性及基因分型檢測

新鮮葉片提取DNA，1%瓊脂糖凝膠進行質(zhì)檢。匯總公開發(fā)表文獻中的4485個SSR標記，對表型變異豐富的十個品種進行標記多態(tài)性檢測。隨后，對單位點模式分離的多態(tài)性標記進行毛細管電泳篩選，利用GeneMarker軟件進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后用于104個品種的基因型關聯(lián)檢測。雜合子基因型作為缺失數(shù)據(jù)處理，罕見等位基因型SSR的次要等位基因頻率（MAF）不大于0.05，對于部分無法歸類的將舍棄處理以此增加關聯(lián)分析的效能。分子標記PIC和基因多樣性利用PowerMarker軟件計算獲得。

2、群體結(jié)構(gòu)與親緣關系分析

群體結(jié)構(gòu)（Q矩陣）的評估是利用STRUCTURE軟件，基于SSR分子標記多態(tài)性進行的。STRUCTURE是一種基于模型的聚類方法，利用多位點基因型數(shù)據(jù)推斷種群結(jié)構(gòu)并將個體分配給群體。應用獨立等位基因頻率的混合模型從1到10估計每一個可能的群（K）。為了得到可靠的亞群，其他參數(shù)設置為一個更高的標準，例如老化長度測試以100000次迭代，每個K跑五次。為了獲得最佳K值，一種通過K值間的LnP(D)變化速率來計算（ΔK）的方法被廣泛應用。如果計算品種的同類可能性 ≥ 0.70則被劃為一組，否則將歸類到混合組中。Nei’s遺傳距離是根據(jù)PowerMarker軟件的無根鄰接樹計算獲得。親緣關系系數(shù)估計矩陣利用SPAGeDi軟件包進行計算。

3、連鎖不平衡分析

一般來說，相關系數(shù)r²是用來評估LD的，常使用的軟件如TASSEL。r²顯著性分析是通過Fisher檢驗計算的，這些SSR標記通過定位到花生的高密度遺傳連鎖圖譜上來評估其LD水平。位于同一連鎖群標記對被視為連鎖的標記，否則為不連鎖標記。LD背景定義為95%不連鎖標記的r²分布，這被視為判斷LD是否為遺傳連鎖的群體特定閾值。遺傳距離的LD衰減是通過區(qū)間間隔而非對應各個標記來估計，基于標記間距離將r²值分為0–0.5、0.5–1、1–2、2–5、5–10、10–15、15–20、20–25、25–50、50–75、75–100和100–150 cM的距離，然后利用非線性回歸函數(shù)對LD衰減進行擬合。LD衰減不僅對整個基因組，而且在A和B亞組水平進行。

4、全基因組關聯(lián)分析

利用TASSEL軟件的簡化混合線性模型（cMLM）來進行關聯(lián)分析，通過同時根據(jù)群體結(jié)構(gòu)（Q矩陣）和相對親緣關系（K矩陣）來限制分散關聯(lián)。在這項研究中，人們使用調(diào)整后的Bonferroni法對關聯(lián)分析進行多重檢驗校正，其中P值閾值為1.81 x 10^-3。

 

研究結(jié)果

1、花生種群結(jié)構(gòu)和親緣關系檢測

在4485個SSR標記中，共有554個SSR標記呈現(xiàn)單點模型的多態(tài)性分離。利用這554個多態(tài)性SSR標記對種群結(jié)構(gòu)進行評估。最顯著的LnP(D)變化出現(xiàn)在K從2到3時，峰值出現(xiàn)在K為3時（圖1）。根據(jù)分組概率分析，所有品種可劃分到三個類群或混合群中的任何一個。Pop1組共有40種（37.70%），其中27種（67.50%）屬于ssp. hypogaea。29種被分到Pop2組，其中96.60%屬于ssp. fastigiata。第三組POP 3包括12種，混合組中有8個（34.80%個）和15個（65.20%個）分別加入到ssp. hypogaea和ssp. fastigiata中。聚類劃分基于Nei’s遺傳距離（圖2）。

 

圖1、花生檢測的群體結(jié)構(gòu)。

（A）兩種方法確定最佳的K值。（B）在K=3情況下計算的群體結(jié)構(gòu)

 

圖2、基于SSR基因分型數(shù)據(jù)的樹狀圖

群體相對親緣關系是通過對554個單點SSR標記檢測進行評價的。平均相對親緣關系值為0.11。超過70%的成對親緣估計值低于0.05，在較高的親緣關系評估類別中，親緣值下降頻率不斷降低，表明這些種質(zhì)之間沒有或有非常弱的遺傳關系（圖3）。

 

圖3、相對親緣關系估計分布圖

2、花生基因組LD衰減分析

花生關聯(lián)LD程度通過定位到20個連鎖群的274個SSR位點r²評估，所有檢測中，平均r²是0.01，大部分（67.10%）r²值顯示出統(tǒng)計學的顯著。并且，在每個群中發(fā)現(xiàn)了高連鎖水平標記（表1）。

表1、所有檢測亞群的連鎖不平衡結(jié)果

 

為了給LD 衰減得到一個特定群體的r²閾值，研究者收集了不連鎖標記背景的LD水平，即 r²=0. 27。發(fā)現(xiàn)全基因組LD衰減到1 cM時的背景就是r²=0. 27（圖4A），并且B亞組LD衰減的比A亞組要快。（圖4B）。

 

 

圖4、104個品種的LD衰減圖（A）全基因組LD衰減 （B）A、B兩亞組的LD衰減

3、花生遺傳多樣性分析

在單點模型中具有多態(tài)性和共分離的SSR標記有554個。最終，在2～12的群體中獲得了1950個等位基因，平均每個位點有3.50個等位基因。平均多態(tài)信息含量為0.47。雖然Pop1組包含最多的種質(zhì)，但每個位點的等位基因（2.70）、基因多樣性（0.25）和PIC（0.22）最低。在四個亞群中，混合群的主等位基因頻率（0.58）最低，而具有最高的單位點等位基因水平（3.40）及基因多樣性（0.53）和PIC（0.47）水平（表2）。

表2、結(jié)構(gòu)分析分組的多樣性相關統(tǒng)計結(jié)果

 

4、種子相關性狀的表型變異分析

分析發(fā)現(xiàn)不同環(huán)境下種子長度、寬度、長寬比及百粒重的情況（圖5，表3-4）

 

圖5、五種環(huán)境下種子相關性狀表型變化分布圖

表3、花生四種種子相關性狀表型變化表

 

5、種子性狀全基因組關聯(lián)定位

總共發(fā)現(xiàn)與表型變異的性狀顯著關聯(lián)標記（MTAs）共30個，能夠解釋11.22到32.30%的表型（表5）。在五個環(huán)境中檢測到9個與SL顯著相關的標記，從11.64到31.45%不等。只有2個標記與種子寬度SW關聯(lián)，但有10個標記與長寬比關聯(lián)。9個標記與百粒重關聯(lián)。

表4、種子相關性狀相關性分析

 

表5、種子相關性狀與標記關聯(lián)情況

 

6、有益等位變異積累分析

從前面的分析中，發(fā)現(xiàn)了多個與種子表型關聯(lián)的SSR標記，發(fā)現(xiàn)AGGS1312和AHGA44686之間有24個單倍性，其中7個可以用于對性狀的評估。

結(jié)論：

• 大部分花生品種在檢測組合中與SSR標記沒有或弱相關， B亞組的LD衰減比A亞組要快。
• 發(fā)現(xiàn)30個與種子性狀顯著相關的SSR標記（P＜1.81x10^-3）。
• 確定了與種子性狀相關有益等位基因的關聯(lián)分子標記，以及相關標記等位基因最佳組合。