靶向捕獲測(cè)序在進(jìn)化及生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用

發(fā)稿時(shí)間：2018-03-15來(lái)源：天昊生物

靶向捕獲測(cè)序在進(jìn)化及生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用

高通量測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，已經(jīng)成功解決了一些數(shù)年前難以想象的生物學(xué)問(wèn)題。靶向捕獲測(cè)序是對(duì)感興趣的基因組區(qū)域預(yù)先擴(kuò)增和富集，然后進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序的一種技術(shù)策略，可以通過(guò)基于PCR的捕獲或者基于固相和液相捕獲探針組等方法實(shí)現(xiàn)。鑒于該策略在技術(shù)上的優(yōu)點(diǎn)和可行性，靶向捕獲測(cè)序在生物進(jìn)化和生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用已經(jīng)越來(lái)越廣泛。

雖然目前測(cè)序成本不斷降低，測(cè)序通量逐漸增大，但是由于不同物種基因組大小和復(fù)雜性的不同，靶向捕獲測(cè)序在某些物種基因組學(xué)及功能研究中仍是最優(yōu)策略。以高比例重復(fù)序列為特征的大基因組(例如火炬松基因組22 Gb，重復(fù)序列約占83%)，這些重復(fù)序列會(huì)對(duì)我們關(guān)心目標(biāo)區(qū)域造成干擾，需要靶向捕獲來(lái)優(yōu)選以避免這些重復(fù)區(qū)域，聚焦基因組序列中的目標(biāo)功能區(qū)域。為此，靶向捕獲廣泛應(yīng)用于具有多倍體基因組和轉(zhuǎn)座子豐度物種的蛋白質(zhì)編碼變異檢測(cè)，完成全基因組測(cè)序無(wú)法解決的物種基因組研究。

靶向捕獲主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)編碼外顯子區(qū)域，但是對(duì)于調(diào)節(jié)區(qū)域如UTR、miRNA、啟動(dòng)子區(qū)域和其它非編碼元件，只要序列GC含量適中，同樣可以進(jìn)行。此外，還可以利用目標(biāo)基因位點(diǎn)的覆蓋均勻性來(lái)基于相對(duì)覆蓋度推斷拷貝數(shù)變化。在這方面使用靶向捕獲是一個(gè)巨大的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)變異(例如全基因組或基因復(fù)制和染色體重排)可以在適應(yīng)和物種形成中發(fā)揮重要作用。當(dāng)然，由于文庫(kù)制備或雜交過(guò)程中引入的偏差可能導(dǎo)致CNV的不準(zhǔn)確，需要在后期根據(jù)實(shí)際情況予以校正。

無(wú)參考基因組的靶向捕獲測(cè)序

靶向捕獲方法的實(shí)施需要以目標(biāo)基因區(qū)段的序列已知為前提。因此，首要問(wèn)題是獲得用于捕獲探針設(shè)計(jì)的目標(biāo)基因區(qū)段序列。對(duì)于有參基因組的物種來(lái)說(shuō)，數(shù)據(jù)庫(kù)信息相對(duì)完備，靶向捕獲的探針設(shè)計(jì)、文庫(kù)制備以及生物信息學(xué)會(huì)容易很多，這里就不展開(kāi)討論了。

對(duì)于生物進(jìn)化及生態(tài)學(xué)領(lǐng)域中涉及的無(wú)參考基因組的物種還有很多。于是，人們針對(duì)無(wú)參考基因組或非模式物種，通過(guò)de novo測(cè)序組裝策略來(lái)獲得靶向捕獲需要的序列信息，這些方法理論上可以應(yīng)用于任何物種。例如，可以使用de novo RNA-seq或表達(dá)序列標(biāo)簽( EST )數(shù)據(jù)來(lái)設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)于外顯子區(qū)域的探針。這里存在的一個(gè)技術(shù)挑戰(zhàn)在于對(duì)外顯子邊界的識(shí)別，因?yàn)榭缭酵怙@子邊界的探針捕獲將造成目標(biāo)區(qū)域的低覆蓋度和較低的總體捕獲性能。外顯子邊界往往是保守的，并且通?？梢酝ㄟ^(guò)與其它不同物種參考基因組的注釋比較來(lái)識(shí)別。此外，也可以對(duì)低覆蓋度全基因組測(cè)序（LC-WGS）測(cè)序序列進(jìn)行de novo組裝，然后根據(jù)目標(biāo)區(qū)域序列設(shè)計(jì)探針進(jìn)行靶向捕獲。LC-WGS數(shù)據(jù)也可以與近緣物種參考基因組比對(duì)，識(shí)別用于捕獲的保守外顯子區(qū)域。

基于de novo組裝的靶向捕獲方法為了降低成本，通常需要進(jìn)行兩次測(cè)序?qū)嶒?yàn)，首先是針對(duì)有代表性的小量樣本的測(cè)序。例如，RNA-seq可以來(lái)自單個(gè)個(gè)體，然后進(jìn)行后期的進(jìn)化和生態(tài)規(guī)模大樣本的靶向捕獲測(cè)序。

何時(shí)采用靶向捕獲測(cè)序？

目前沒(méi)有一個(gè)放之四海而皆準(zhǔn)的測(cè)序策略能夠解決所有生物學(xué)問(wèn)題，需要根據(jù)具體的研究?jī)?nèi)容及目標(biāo)進(jìn)行調(diào)整。靶向捕獲測(cè)序可以應(yīng)用于生物進(jìn)化和生態(tài)研究的幾個(gè)活躍領(lǐng)域包括：

• 表型性狀的遺傳作圖

遺傳作圖仍然是鑒定表型進(jìn)化的遺傳機(jī)制的主要方法之一。通過(guò)雜交或關(guān)聯(lián)研究的QTL作圖需要有遺傳圖譜信息。然而，作圖研究很少可以達(dá)到單個(gè)基因或標(biāo)記分辨率。在這些情況下，靶向捕獲測(cè)序可用于將未知遺傳變異信息錨定到已知基因或其它功能元件上，從而真正尋找到關(guān)鍵變異位點(diǎn)。

• 檢測(cè)基因組中的選擇

自然選擇是控制進(jìn)化變化的重要方面。基因組測(cè)序技術(shù)可以讓人們了解不同生物體基因組中選擇頻率、模式和分布情況。然而目前評(píng)估大規(guī)模選擇模式所需的數(shù)據(jù)主要來(lái)自于參考基因組完備的類(lèi)群。因此為了加深我們對(duì)形成遺傳多樣性的進(jìn)化過(guò)程的理解，需要將這些研究擴(kuò)展到不同的自然群體。對(duì)目標(biāo)外顯子、側(cè)翼內(nèi)含子、上下游調(diào)控序列的長(zhǎng)連續(xù)區(qū)域或甚至非編碼基因間區(qū)域上的大片區(qū)域的檢測(cè)，可以提供強(qiáng)大的選擇性掃描，估計(jì)選擇性掃描強(qiáng)度和基因組變化速率的能力。

• 系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究

靶向捕獲測(cè)序的靈活性為系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究提供了巨大的優(yōu)勢(shì)技術(shù)。定制的捕獲設(shè)計(jì)可以針對(duì)數(shù)百或數(shù)千個(gè)位點(diǎn)，以解決一系列系統(tǒng)發(fā)育問(wèn)題。為了最大化系統(tǒng)發(fā)育信息，選擇進(jìn)化速率適合于解決給定關(guān)系的基因座非常重要。例如，深層系統(tǒng)發(fā)育節(jié)點(diǎn)是通過(guò)進(jìn)化緩慢的序列來(lái)解析的，這些序列在遙遠(yuǎn)的分類(lèi)群中保留了正交信號(hào)。基于簡(jiǎn)化基因組方法得到的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育推斷，其大部分低于屬水平。靶向捕獲測(cè)序能夠捕獲緩慢進(jìn)化的超保守元件標(biāo)記物，已成為解決脊椎動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)育中深層節(jié)點(diǎn)的一種非常有前景的方法。此外，靶向捕獲測(cè)序可以來(lái)解決群體遺傳的有效性問(wèn)題，例如有效群體大小、基因流動(dòng)、系統(tǒng)地理學(xué)等。

• 古代DNA與宏基因組學(xué)的應(yīng)用

從古生物遺骸、沉積物和博物館標(biāo)本中提取的古代或歷史DNA (aDNA )可以提供對(duì)譜系進(jìn)化歷史的證據(jù)。處理古生物學(xué)樣品中的aDNA樣品的一個(gè)挑戰(zhàn)是從細(xì)菌DNA和靶DNA的復(fù)雜混合物中分離感興趣的序列。例如，約55000年的人骨碎片的殘余物中約99 %的污染環(huán)境DNA組成。通過(guò)設(shè)計(jì)捕獲特定靶序列的探針，可以大大減少了大量污染物DNA測(cè)序的問(wèn)題。目前，從環(huán)境樣品中分離和測(cè)序DNA(宏基因組學(xué))以研究病原體進(jìn)化或微生物群落組成也是一個(gè)熱門(mén)領(lǐng)域。此外，靶向捕獲可以提供高通量的方法來(lái)對(duì)物種條形碼進(jìn)行檢測(cè)，分析群落組成，探索群落中的功能變化，例如靶向檢測(cè)特定生態(tài)功能下的基因等。

參考文獻(xiàn)

1. Targeted capture in evolutionary and ecological genomics. Molecular Ecology, 2016

2. From genomes to GENE-omes exome sequencing concept and applications in crop Improvement. Frontiers in Plant Science, 2017

關(guān)于天昊

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