天昊目的區(qū)域甲基化MethylTarget?檢測(cè)技術(shù)動(dòng)物領(lǐng)域首發(fā)新文

發(fā)稿時(shí)間：2018-04-12來(lái)源：天昊生物

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生理生化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室近期在《Poultry Science》上發(fā)表了補(bǔ)充甜菜堿促進(jìn)蛋雞類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白和卵黃沉積腎上腺皮質(zhì)酮表達(dá)的文章。在這項(xiàng)研究中使用了天昊生物創(chuàng)新性的高通量高靈敏度甲基化水平檢測(cè)技術(shù)MethylTarget^?。在恭喜客戶又發(fā)表文章同時(shí)，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目：Dietary betaine supplementation increases adrenal expression of steroidogenic acute regulatory protein and yolk deposition of corticosterone in laying hens

中文題目：補(bǔ)充甜菜堿促進(jìn)蛋雞類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白和卵黃沉積腎上腺皮質(zhì)酮的表達(dá)

期刊名：Poultry Science       影響因子： 1.908

技術(shù)：高通量高靈敏度甲基化水平檢測(cè)技術(shù)MethylTarget^?

實(shí)驗(yàn)描述

如皋黃羽蛋雞在38周齡分為對(duì)照組和甜菜堿組，每組60只母雞，每組20個(gè)籠子（每籠3只母雞）。分別飼喂基礎(chǔ)日糧和甜菜堿添加日糧，共4周。記錄初始體重、產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)參數(shù)。在飲食治療結(jié)束后，每組取12只體重正常的母雞進(jìn)行采樣和進(jìn)一步分析。解剖腎上腺，液氮快速冷凍，保存在?80?C做進(jìn)一步分析。收集最后一天飲食處理的雞蛋，每組隨機(jī)抽取12個(gè)雞蛋，蛋黃被分離、均質(zhì)和冷凍保存在?80?C直到提取皮質(zhì)和總膽固醇測(cè)定。抽取血液樣本，分離血漿和存儲(chǔ)在?20?C。

研究目的: 

甜菜堿（Betaine）是一種重要的甲基供體，通過(guò)基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控實(shí)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)重編程實(shí)現(xiàn)。本研究探討了甜菜堿對(duì)蛋雞的飼喂是否會(huì)影響腎上腺皮質(zhì)糖皮質(zhì)激素合成和卵子中皮質(zhì)酮的沉積，以及是否與甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)及受影響基因的啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)有關(guān)。

 

圖1 蛋氨酸循環(huán)示意圖。 BHMT：甜菜堿-同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶；MAT2B: 腺苷蛋氨酸；SAM: S-腺苷甲硫氨酸； DNMTs：DNA甲基轉(zhuǎn)移酶； GNMT：甘氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶；AHCYL1:腺苷高半胱氨酸酶1；StAR: 類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白；SF-1：類固醇生成因子-1

研究結(jié)果：

產(chǎn)蛋性能

甜菜堿對(duì)體重和蛋品質(zhì)參數(shù)沒(méi)有顯著影響，如蛋重、蛋黃重、蛋長(zhǎng)和蛋殼強(qiáng)度（表2）。甜菜堿處理組平均產(chǎn)蛋率顯著高于對(duì)照組（p＜0.05）（表2）。

表2  蛋雞體重和蛋參數(shù)的研究

 

血漿生化參數(shù)

如表3所示，甜菜堿處理組的總膽固醇和甘油三酯濃度顯著高于對(duì)照組。此外，膳食甜菜堿補(bǔ)充顯著增加低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT），而總蛋白（TP）、葡萄糖（GLU）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）不受影響。

表3  血漿生化參數(shù)

 

雞蛋皮質(zhì)酮和腎上腺中膽固醇含量

蛋雞喂養(yǎng)甜菜堿顯著升高蛋黃皮質(zhì)酮含量（圖2A），而不改變血漿皮質(zhì)酮（圖2B）和雞蛋總膽固醇含量（圖2C）。甜菜堿處理的雞體內(nèi)總膽固醇含量顯著下降（圖2D）。

 

圖2  A）雞蛋CORT濃度；B）血漿CORT濃度；C）雞蛋總膽固醇含量；D）腎上腺總膽固醇含量。

腎上腺類固醇相關(guān)基因的表達(dá)

蛋雞飼糧添加甜菜堿顯著上調(diào)腎上腺StAR（類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白）, 其轉(zhuǎn)錄因子SF-1（類固醇生成因子-1）以及GR（糖皮質(zhì)激素受體）mRNA的表達(dá)（圖3A）。

 

圖3 甜菜堿對(duì)腎上腺參與類固醇激素合成和甲基轉(zhuǎn)移基因表達(dá)的影響。A）腎上腺類固醇激素合成基因mRNA表達(dá)； 

腎上腺蛋氨酸代謝基因的表達(dá)

與對(duì)照組相比，甜菜堿組中，蛋氨酸代謝基因（AHCYL, DNMT1, DNMT3a）mRNA的豐度顯著上調(diào)，BHMT（甜菜堿-同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶）、甲硫氨酸腺苷基轉(zhuǎn)移酶（MAT2B）和甘氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶（GNMT1）則保持不變（圖3B）。

 

圖3 甜菜堿對(duì)腎上腺參與類固醇激素合成和甲基轉(zhuǎn)移基因表達(dá)的影響。B）腎上腺BHMT, MAT2B, AHCYL1, DNMT1, DNMT3A mRNA表達(dá)。

StAR和SF-1基因啟動(dòng)子的CpG甲基化

對(duì)腎上腺基因組DNA進(jìn)行了MethylTarget^?技術(shù)分析，對(duì)于StAR基因啟動(dòng)子，CpG島的片段2包含16個(gè)CpG位點(diǎn)（?2,554 to ?2,290），而片段1包含12個(gè)CpG位點(diǎn)（?2,318 to ?2,087）（圖4A）。StAR基因啟動(dòng)子片段1（圖4B）和片段2（圖4C）具有5種高頻率的甲基化單倍型，片段1（圖4D）和片段2（圖4E）對(duì)照組和甜菜堿組之間的單倍型頻率差異如圖所示：片段1中的單倍型3和4，片段2的單倍型1和5的頻率在甜菜堿組顯著低于對(duì)照組，而片段2的單倍型3在甜菜堿組顯著高于對(duì)照組。這2個(gè)片段上數(shù)個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化程度在甜菜堿和對(duì)照組有差異，但差異程度不一致，有些CpG位點(diǎn)在甜菜堿組相對(duì)于對(duì)照組是低甲基化，而有些CpG位點(diǎn)則是高甲基化（片段1：圖4F；片段2：圖4G）。

 

圖4 腎上腺StAR基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。A) 雞StAR基因啟動(dòng)子序列示意圖。B) StAR基因片段1不同甲基化單倍型示意圖。C) StAR基因區(qū)段2不同甲基化單倍型示意圖。D) StAR基因啟動(dòng)子片段1甲基化單倍型百分比。E) StAR基因啟動(dòng)子片段2甲基化單倍型百分比。F)對(duì)照組和甜菜堿組片段1CpG位點(diǎn)甲基化程度差異。G)對(duì)照組和甜菜堿組片段2CpG位點(diǎn)甲基化程度差異。

 

對(duì)于SF-1基因啟動(dòng)子，只對(duì)1個(gè)片段進(jìn)行了分析（圖5A），這個(gè)片段包含21個(gè)CpG位點(diǎn)（?3,935 to ?3,699）。SF-1基因啟動(dòng)子的前5個(gè)高頻率甲基化單倍型如圖5B所示。對(duì)照組和甜菜堿組之間的單倍型頻率差異如圖5C所示, 單倍型2, 4和5的頻率在甜菜堿組中顯著低于對(duì)照組。SF-1基因啟動(dòng)子的21個(gè)CpG位點(diǎn)有14個(gè)CpG位點(diǎn)在甜菜堿組中是低甲基化的。

 

圖5 腎上腺SF-1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。A) 雞SF-1基因啟動(dòng)子序列示意圖。B) SF-1基因不同甲基化單倍型示意圖。C) SF-1基因啟動(dòng)子片段1甲基化單倍型百分比。D)對(duì)照組和甜菜堿組CpG位點(diǎn)甲基化程度差異。

總結(jié)：

• 補(bǔ)充甜菜堿能顯著增加平均產(chǎn)蛋率，而體重和蛋品質(zhì)保持不變。
• 在甜菜堿組，血漿膽固醇和低密度脂蛋白濃度也較高。
• 甜菜堿組雞蛋蛋黃中的皮質(zhì)酮較高，這與腎上腺類固醇合成基因的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。
• 類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白（StAR），連同其轉(zhuǎn)錄因子類固醇生成因子（SF-1）和糖皮質(zhì)激素受體被顯著激活。
• 補(bǔ)充甜菜堿能顯著上調(diào)腺苷同型半胱氨酸酶1，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a（DNMT3a）的腎上腺mRNA表達(dá)。
• 亞硫酸氫鹽測(cè)序分析顯示腎上腺SF-1基因啟動(dòng)子區(qū)的數(shù)個(gè)CpG位點(diǎn)具有顯著的低甲基化。
•  這些結(jié)果表明，蛋雞補(bǔ)充甜菜堿可以激活StAR腎上腺表達(dá)，可能是通過(guò)SF-1基因的表觀遺傳調(diào)控達(dá)到的。

天昊創(chuàng)新性高通量高靈敏度甲基化水平檢測(cè)技術(shù)MethylTarget^?：

• 性價(jià)比高：傳統(tǒng)克隆測(cè)序一個(gè)片段10個(gè)克隆的價(jià)格，MethylTarget可以完成約60個(gè)片段的檢測(cè)（檢測(cè)深度為1000X，相當(dāng)于1000個(gè)克?。?
• 精確度高：基于二代測(cè)序數(shù)據(jù)檢測(cè)甲基化程度，精確到單堿基分辨率，與基于測(cè)序的全基因組甲基化測(cè)序，RRBS數(shù)據(jù)有高度一致性
• 精確定量：測(cè)序深度高達(dá)1000X，并可以進(jìn)一步加深，相比于傳統(tǒng)克隆測(cè)序，可以對(duì)位點(diǎn)甲基化程度進(jìn)行準(zhǔn)確定量
• 技術(shù)靈活：基于多重PCR富集進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域富集，可隨時(shí)進(jìn)行基因和位點(diǎn)的變化和改動(dòng)，并且可以獲得每個(gè)片段的甲基化單倍型