Microbiome：結(jié)直腸癌宏基因組多隊(duì)列分析鑒定到人群間的細(xì)菌改變和通用細(xì)菌標(biāo)記

發(fā)稿時(shí)間：2018-04-26來(lái)源：天昊生物

英文題目： Multi-cohort analysis of colorectal cancer metagenome identified altered bacteria across populations and universal bacterial markers

期刊名：Microbiome            發(fā)表時(shí)間： 2018.4          影響因子：  8.496

背景：不同人群中腸道菌群的改變與結(jié)直腸癌（CRC）相關(guān),目前發(fā)現(xiàn)幾種細(xì)菌有助于腫瘤的發(fā)生，對(duì)于腸道微生物作為早期診斷標(biāo)志物的潛在應(yīng)用也有報(bào)道。然而，隊(duì)列特異性噪聲可能會(huì)扭曲CRC中微生物失調(diào)的結(jié)構(gòu)，并導(dǎo)致研究結(jié)果不一致。本研究旨在探索不同人群間種水平上普遍改變的腸道微生物群落。

研究結(jié)果：

隊(duì)列間微生物群落組成

我們積累了來(lái)自四個(gè)隊(duì)列，美國(guó)（USA）、奧地利(AT)、中國(guó)（HK）、德國(guó)和法國(guó)（FD），包括271個(gè)對(duì)照組和255例CRC（人口統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨床和技術(shù)細(xì)節(jié)，如表1所示）的宏基因組測(cè)序序列。

表1 糞便樣品的人口學(xué)、臨床和技術(shù)細(xì)節(jié)

USA、AT和FD隊(duì)列中CRC病例和對(duì)照組間香農(nóng)多樣性指數(shù)差異不顯著，然而，與HK隊(duì)列對(duì)照組相比，病例組多樣性指數(shù)顯著降低。主坐標(biāo)分析確定了不同群體間細(xì)菌組成存在顯著差異（圖1a: control; 圖1b: CRC），還發(fā)現(xiàn)CRC病例和對(duì)照組間細(xì)菌總體組成有顯著差異（圖1c）。

圖1. 不同人群間微生物組成和統(tǒng)計(jì)差異。a-c:對(duì)照樣本、CRC樣本和所有樣本各自的主坐標(biāo)分析。d: 檢測(cè)不同豐度細(xì)菌（不同細(xì)菌豐度變化程度(fold change=10, 20, 40%)vs隊(duì)列樣本大小（對(duì)照樣本數(shù)×病例樣本數(shù)））的統(tǒng)計(jì)功效。

隊(duì)列間CRC和對(duì)照組豐度差異細(xì)菌

進(jìn)行了模擬分析，比較了meta分析和單隊(duì)列研究之間的統(tǒng)計(jì)功效。模擬分析表明，細(xì)菌豐度變化20%時(shí)估計(jì)功效為0.88；單一隊(duì)列研究細(xì)菌豐度變化倍數(shù)為20%時(shí)估計(jì)功效則為0.5，這顯示隊(duì)列間優(yōu)于單一隊(duì)列研究（圖1d）。利用meta分析來(lái)鑒定4個(gè)隊(duì)列間CRC和對(duì)照組豐度差異細(xì)菌。使用秩和法，確定了7個(gè)CRC富集菌種和62個(gè)CRC減少菌種（圖2a）。在這七個(gè)CRC富集菌種中， Bacteroides fragilis在所有四個(gè)人群中始終富集，而五個(gè)細(xì)菌(P. asaccharolytica, P. micra, P. intermedia, A. finegoldii, and T. acidaminovorans)在四個(gè)隊(duì)列中的兩個(gè)其豐富度表現(xiàn)出明顯的變化（圖2b）。在62個(gè)CRC減少細(xì)菌中有五種細(xì)菌被報(bào)道對(duì)健康有益，包括Clostridium butyricum, Streptococcus salivarius, Streptococcus thermophilus, Carnobacterium maltaromaticum, Lactobacillus gallinarum。為了確定這69個(gè)CRC相關(guān)細(xì)菌是否與CRC進(jìn)程相關(guān)，我們研究了它們?cè)?/span>CRC早期和晚期階段中的豐度差異，3種細(xì)菌（Streptococcus sp. I-G2, Shewanella woodyi, Mycoplasma penetrans）對(duì)照組、早期CRC和晚期CRC呈下降趨勢(shì)。

圖2. 不同群體中CRC豐度差異的細(xì)菌。a 最大變化程度的7個(gè)CRC富集菌種和20個(gè)CRC減少菌種（左圖）, 個(gè)體配對(duì)變化程度的置信區(qū)間（右圖）。b 7個(gè)CRC富集細(xì)菌在不同群體中的豐度。c 基于7個(gè)CRC富集菌種的SVM模型預(yù)測(cè)能力。

使用細(xì)菌標(biāo)記物區(qū)分CRC和對(duì)照組

為了區(qū)分CRC患者和對(duì)照組，將七個(gè)CRC富含細(xì)菌物種裝配到（SVM）模型中。獲得的USA, AT, HK, FD 隊(duì)列AUC曲線面積分別為0.83, 0.87, 0.84, 0.82。所有人群樣本的AUC為0.80。當(dāng)把臨床表型信息（年齡，性別和體重指數(shù)）納入以后，總的AUC增加到0.88（圖2c）。七個(gè)CRC富集菌種在AT，HK和FD隊(duì)列中區(qū)分早期CRC病例和對(duì)照的AUCs分別為0.84、0.82、0.84，提示其在早期CRC病例和對(duì)照之間的杰出分類(lèi)性能。

CRC相關(guān)細(xì)菌之間的相關(guān)性

為了從生態(tài)學(xué)的角度深入了解細(xì)菌與細(xì)菌的相互作用，進(jìn)一步研究?；?/span>SparCC算法調(diào)查了CRC富集菌與CRC減少細(xì)菌之間的相關(guān)性。觀察到CRC富集和減少的細(xì)菌分別形成了各自的共生網(wǎng)絡(luò)，彼此呈負(fù)相關(guān)。有趣的是：CRC減少細(xì)菌中顯著相關(guān)對(duì)的數(shù)量和相關(guān)強(qiáng)度在對(duì)照組高于CRC病例組（圖3b）。CRC富集細(xì)菌和CRC減少細(xì)菌之間大多數(shù)是負(fù)的。七個(gè)CRC富集菌在CRC早期比CRC晚期的相關(guān)性更為密切，它們之間相關(guān)網(wǎng)絡(luò)在CRC后期被破壞了。以加權(quán)程度為中心，發(fā)現(xiàn)梭狀芽孢桿菌（Clostridium）在網(wǎng)絡(luò)中中心性最高，這些中心物種可能在網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用，與去除隨機(jī)節(jié)點(diǎn)相比，當(dāng)去除梭菌物種的節(jié)點(diǎn)時(shí)，網(wǎng)絡(luò)連通性急劇下降。

圖3 CRC相關(guān)細(xì)菌之間相關(guān)性的Meta分析。a  CRC樣品中69個(gè)CRC富集或減少細(xì)菌之間的相關(guān)性。圓之間的相關(guān)節(jié)點(diǎn)用深藍(lán)色標(biāo)記。四個(gè)CRC富集的口腔菌種用暗紅色標(biāo)記，五個(gè)共生細(xì)菌以三角形表示，節(jié)點(diǎn)的大小與它們對(duì)應(yīng)的中心性成正比。b CRC減少細(xì)菌的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)在對(duì)照組和CRC組之間的比較。

CRC富集和減少細(xì)菌相關(guān)的功能基因家族

將宏基因組序列映射到UniRef數(shù)據(jù)庫(kù)，使用HUMAnN2將其分為10675個(gè)GO和8695 個(gè) KO。共有311個(gè)GO分類(lèi)和217個(gè)KO發(fā)現(xiàn)在CRC中富集， 31個(gè)GO和74個(gè)KO在CRC中減少。使用Spearman調(diào)查了七個(gè)CRC富集物種和GO/KO之間的相關(guān)性，確定了167個(gè)GO和143個(gè)KO與CRC富集細(xì)菌有顯著的正相關(guān)（圖4），我們定義了這些GO/KO為CRC富集細(xì)菌相關(guān)的GO / KO類(lèi)別。為了研究相關(guān)的功能途徑，我們將KO分類(lèi)映射到KEGG通路，參與同一途徑的KO被視為相關(guān)KO類(lèi)別。鑒別了與癌癥發(fā)展相關(guān)被多個(gè)KO共享的通路，發(fā)現(xiàn)了7個(gè)KEGG通路在CRC中富集（圖4）。一些共生細(xì)菌被發(fā)現(xiàn)與CRC減少的GO/KO類(lèi)別相關(guān)：Clostridium butyricum，Carnobacterium maltaromaticum與GO051606（刺激檢測(cè)）密切相關(guān)；Streptococcus salivarius， S.thermophiles分別與K07104（鄰苯二酚2,3-雙加氧酶）和K07570（一般應(yīng)激蛋白13）相關(guān)。

圖4  CRC富集細(xì)菌與KO之間的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)。相同顏色的節(jié)點(diǎn)共享相同的CRC富集路徑。

結(jié)果總結(jié)：

• 基于來(lái)自中國(guó)、奧地利、美國(guó)、德國(guó)和法國(guó)隊(duì)列的526個(gè)宏基因組樣本的組合分析，在不同人群間鑒定到七個(gè)CRC富集的細(xì)菌(Bacteroides fragilis, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas asaccharolytica, Parvimonas micra, Prevotella intermedia, Alistipes finegoldii, and Thermanaerovibrio acidaminovorans)。
• 七個(gè)富集的細(xì)菌標(biāo)記使用AUC曲線可以將不同人群間的對(duì)照和病例區(qū)分開(kāi)。
• 豐度相關(guān)分析表明，CRC富集和CRC減少的細(xì)菌分別形成了自己的共生網(wǎng)絡(luò)。
• 發(fā)現(xiàn)CRC富集的細(xì)菌與脂多糖和能量生物合成途徑相關(guān)。

結(jié)論：

•    本研究發(fā)現(xiàn)潛在的細(xì)菌診斷標(biāo)志物在人群間是穩(wěn)健的，提示其在無(wú)創(chuàng)性CRC診斷中的潛在應(yīng)用價(jià)值，本研究還闡明了CRC相關(guān)微生物群的生態(tài)網(wǎng)絡(luò)和功能容量。