Nature Genetics：3’ UTR變短能夠通過干擾ceRNA的crosstalk以反式作用方式抑制腫瘤抑癌基因

發(fā)稿時間：2018-08-03來源：天昊生物

 

摘要一覽

由可變聚腺苷酸化（alternative polyadenylation，APA）引起的mRNA 3’ UTR變短（3’ US）是一種常見現(xiàn)象，它可以促進體內腫瘤生長。此前的假設普遍認為，這一過程通過順式作用來逃脫由microRNA介導的對原癌基因表達抑制。本研究卻發(fā)現(xiàn)，3’ UTR變短在被預測為腫瘤抑制基因的競爭內源性RNAs (ceRNAs)轉錄本中得到了驚人的富集。研究者基于3’ UTR變短（MAT3UTR）的反式效應模型分析揭示了其在改變ceRNA表達中的重要作用。MAT3UTR預測了許多3’ UTR變短的反式靶點，包括PTEN，它是一個關鍵腫瘤抑制基因，參與了9個3’ UTR變短基因（包括EPS15和NFIA） ceRNA 的crosstalk。對3’ UTR變短調節(jié)子基因NUDT21敲降后，以miRNA依賴的反式作用方式抑制了PHF6和LARP1抑癌基因的表達。綜上所述，本研究結果表明，3’ UTR變短能夠通過干擾ceRNA的crosstalk以反式作用方式，抑制腫瘤抑癌基因，而不是誘導順式作用的原癌基因導致腫瘤發(fā)生的。

 

 

 

發(fā)表期刊：Nature Genetics 發(fā)表時間：2018-5-21 影響因子：27.125

 

背景介紹及研究意義

在細胞增殖和轉化過程中，普遍存在著APA引起的mRNA3’ UTR變短的發(fā)生。先前人們的假設認為，變短的3’ UTR通過逃脫miRNA介導的抑制而導致順式中原癌基因的激活。本研究挑戰(zhàn)了這一假設，并暗示了3’ US在腫瘤發(fā)生中的不同功能，本研究有助于深入揭示腫瘤的發(fā)生機理。

 

 

可變聚腺苷酸化示意圖

圖片來源：https://en.wikipedia.org/wiki/Polyadenylation

 

 

研究方法

RNA-Seq、miRNA-Seq及ceRNA鑒定，RIP，qRT-PCR等。

 

研究結果

 

圖1、3’ US (3’ UTR shortening)基因與癌基因沒有強關聯(lián)。a) TCGA RNA-Seq數(shù)據(jù)顯示CCND1的3’ UTR區(qū)在腫瘤(黃色)和正常樣本(藍色)之間沒有明顯變化。Poly(A)-seq結果觀察到類似的模式。b) 358例TCGA腫瘤/正常樣本中3’ US基因(紅色)和所有基因(灰色)的ΔPDUI值(上圖)。負ΔPDUI表示3’ US變短。下圖顯示了358個腫瘤/正常樣本中CCND1的ΔPDUI值?？梢姡?CCND1 3’ UTR發(fā)生顯著變短的發(fā)生腫瘤的僅展非常小的部分( 358人中有8人；2.2 % )。c）前期研究鑒定的3’US基因和癌基因之間的重疊P值及比率。

 

 

圖2、3’ UTR變短干擾ceRNET（ceRNA global regulatory networks）。a）乳腺腫瘤和匹配的正常組織中隨機選擇100000轉錄本對時有顯著的miRNA結合位點重疊的Pearson相關系數(shù)。b）乳腺腫瘤和正常ceRNETs中ceRNA對的數(shù)量。括號中的數(shù)字為歸一化的腫瘤和正常樣本之間共享邊數(shù)。c）EPS15 (3’ US基因)和PTEN ( ceRNA partner )在68例雌激素受體陽性乳腺腫瘤和匹配正常樣本上的基因表達。水平線代表PTEN的平均表達值，在腫瘤中出現(xiàn)下降(FDR = 2.1×10^-10 )。d）熱圖顯示了68個ERP腫瘤/正常對(列)中按照3’ US基因的數(shù)量排序顯著的APA(alternative polyadenylation)事件(行)。Venn圖顯示了正常和腫瘤ceRNET中ceRNA對的數(shù)量。括號中的數(shù)字為腫瘤和正常組織歸一化后共享的邊數(shù)。P值是根據(jù)單尾皮爾遜卡方檢驗計算結果。

 

 

 

圖3、3’ UTR變短抑制TCGA乳腺癌中的腫瘤抑制基因表達。a）3’ US ceRNA hub基因(紅色)、3’ US ceRNA non-hub基因(藍色)、3’ US基因(紫色)和隨機RefSeq基因(灰色)的功能富集結果。本研究隨機抽樣每個基因類別到相同的數(shù)量各100次；繪制了具有標準偏差的平均P值。b）3’ US ceRNAs (n = 160，左框)抑癌基因的相對表達(腫瘤/正常)低于不在ceRNET中的抑癌基因( n = 226，右框)。c）3’ US基因(左)可能通過3’UTR變短釋放的miRNAs (中間)通過反式作用抑制其ceRNA伴侶PTEN表達。d）上面熱圖顯示了9個3’ US基因(行)的APA事件。下圖顯示了10種腫瘤中PTEN的表達水平，其中UTR變短最多(左)或最少(右)。e）用對照(Con.)或EPS15靶向siRNAs處理的MCF細胞裂解物的Western blot分析。這幅圖代表了三個獨立的實驗。f）為用含有PTEN 3’ UTR和EPS15靶向siRNAS的熒光素酶報告基因轉染的MCF7細胞裂解物的熒光素酶活性定量結果。g）PTEN 3’ UTR熒光素酶報告基因在轉染了EPS15和DICER靶向siRNAS的MCF7細胞中的活性。h）用含有載體衍生的3’ UTR (Con.)或EPS 15 3’ UTR以及GFP構建體的異源報告基因轉染的MCF7細胞的間接免疫熒光。通過與Alexa Fluor - 594結合的抗PTEN抗體檢測PTEN。箭頭突出顯示PTEN +轉染的細胞。

 

 

圖4、NUDT21介導的3’ UTR變短導致腫瘤抑制因子以反式作用被抑制。a) 在NUDT21敲降(KD)實驗中，癌基因或抑癌基因中3’ US ceRNAs (紅色)、3’ US 基因(藍色)和RefSeq基因 (灰色)的富集情況。實驗對每個基因類別隨機抽取到相同的數(shù)量(n=1168) 100次，并得到標準偏差的平均P值。b）3’ US ceRNAs ( n = 57，左框)或未與3’US基因關聯(lián)( n = 339，右框)的抑癌基因的表達變化。3’US ceRNA抑癌基因在NUDT21敲降樣品中表達較低( P = 0.03 )。c）使用CRISPR / Cas9在HeLa細胞中敲降NUDT21的通過western blot檢測。d）用AGO2抗體進行RIP實驗，以正常小鼠IgG作為對照。用western blot檢測RIP復合物。

 

圖5、NUDT21介導的3’ UTR變短抑制腫瘤抑制基因PHF6和LARP1。a）NUDT21敲降細胞3’ US ceRNA腫瘤抑制基因(PHF6/LARP1)和3’ US基因(LAMC1/YOD1)的Western blot結果。b）在NUDT21敲降細胞和對照siRNA轉染細胞中，PHF6 3’ UTR和LARP1 3’ UTR熒光素酶活性檢測。c）NUDT21敲降誘導YOD1的3’ UTR變短和表達上調，使得miR-3187-3p和miR-549抑制PHF6。d），使用轉染NUDT21siRNA (si-NUDT21-4)的HeLa細胞裂解物和兩種阻斷miR-549和miR-3187-3p的拮抗劑的western blot分析。e) PHF6 3’ UTR熒光素酶報告載體在具有siRNAs、miRNAs或拮抗劑的HeLa細胞中的活性。f）用對照siRNA或YOD1 siRNA轉染的細胞裂解物的western blot分析。g）在用與f中相同的實驗設計處理的細胞中PHF6 3’ UTR熒光素酶的活性。h）用siRNAs轉染的細胞中PHF6熒光素酶的活性檢測。

 

結論

1、通過對TCGA數(shù)據(jù)庫RNA-Seq等數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)，3’ US基因與原癌基因不存在強關聯(lián)現(xiàn)象。

2、ceRNA可以通過反式作用形成調控網(wǎng)絡（ceRNET）來控制生物活動進程。本研究通過對TCGA數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)3’ UTR變短可以干擾ceRNET。

3、對TCGA乳腺癌數(shù)據(jù)分析及功能驗證實驗表明，3’ UTR變短抑制TCGA乳腺癌中的腫瘤抑制基因的表達。

4、對3’ US關鍵因子NUDT21的細胞敲降實驗表明，NUDT21介導了3’US ceRNA抑癌基因（如PHF6和LARP1）以反式作用被抑制。

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