一問一答一世界：了解天昊生物微生物16S擴增子絕對定量測序技術(shù)

發(fā)稿時間：2018-11-01來源：天昊生物

                

Q1: 開發(fā)微生物16S擴增子絕對定量測序技術(shù)的初衷是什么？

A:

• 客戶多次提出環(huán)境樣本中指定微生物的絕對定量需求
• 常規(guī)的qPCR實驗不適用于組成復(fù)雜的環(huán)境樣本，實驗結(jié)果不穩(wěn)定
• 特定物種需特定qPCR引物，前期評估及優(yōu)化難度大
• 針對環(huán)境樣本指定物種的絕對定量類型項目有普適性方法

Q2: 目前qPCR技術(shù)在微生物定量研究中的短板是什么？

A: qPCR絕對定量技術(shù)是將已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品梯度進行稀釋，進行qPCR檢測，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，對樣品進行目的基因qPCR檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以計算樣品中物種的絕對拷貝數(shù)，雖然可以進行物種絕對定量分析，但是特定物種qPCR檢測需要設(shè)計特定的引物，對引物特異性要求較高，且引物優(yōu)化難度較大。

 

Q3: 目前常規(guī)16S擴增子測序技術(shù)在微生物定量研究中的短板是什么？ 

A: 常規(guī)16S擴增子測序技術(shù)是針對所有細菌共有的16S區(qū)域進行PCR擴增，將目標(biāo)區(qū)域DNA擴增富集后進行高通量二代測序，然后將得到的序列與特定數(shù)據(jù)庫比對，確認物種，通過OTUs聚類分析，就可以知道樣品中的細菌結(jié)構(gòu)組成和不同細菌的相對豐度, 雖然其具有高通量測序，大數(shù)據(jù)量、低花費，可客觀還原菌群結(jié)構(gòu)及相對豐度比例的巨大優(yōu)勢，但是其是通過某一OTU分類單元的序列數(shù)所占總序列數(shù)的比值來獲得某個細菌的相對豐度比例信息，并不能反映樣本中物種真實的絕對豐度情況，因此通過此技術(shù)得到的結(jié)果說X菌在A組相對于B組增多是錯誤的，應(yīng)該是X菌在A組中的豐度比例相對于B組增多。

 

Q4: 微生物16S擴增子絕對定量測序相對于qPCR絕對定量技術(shù)和常規(guī)擴增子測序技術(shù)有什么明顯優(yōu)勢？

A: 微生物16S擴增子絕對定量測序是一種將qPCR絕對定量技術(shù)和常規(guī)擴增子測序技術(shù)合二為一的一種創(chuàng)新性技術(shù)，可以說微生物16S擴增子絕對定量測序=常規(guī)16S擴增子測序+總細菌qPCR絕對定量+特定菌種qPCR絕對定量，因此通過微生物16S擴增子絕對定量測序既可以解析樣本中總細菌的絕對拷貝數(shù)；解析樣本中特定物種的絕對拷貝數(shù)；也可以進行Alpha多樣性分析、群落組成分析、Beta多樣性分析和環(huán)境因子分析等常規(guī)擴增子測序分析內(nèi)容。

 

Q5: 微生物16S擴增子絕對定量測序的技術(shù)原理是什么？

A: 該方法通過向樣品DNA中添加已知拷貝數(shù)spike-in人工合成序列，然后將樣本進行16S擴增子文庫構(gòu)建、測序，再根據(jù)spike-in的16S擴增子reads數(shù)及其絕對拷貝數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)OTU reads數(shù)，計算出樣品中OTU代表序列對應(yīng)物種16S rRNA基因絕對拷貝數(shù)。添加16S spike-in到樣品模板中進行16S rRNA基因擴增子高通量測序較好的解決了環(huán)境樣本中微生物的絕對定量問題，同時也能得到樣本中的物種組成信息。

 

Q6: 目前微生物16S擴增子絕對定量測序技術(shù)的樣本類型和樣本量有哪些要求？

A:目前樣品類型包括：常規(guī)土壤樣本和糞便樣本，其它樣本類型則需要評估。如果客戶直接送樣本，要求：土壤≥5 g；糞便≥2 g；如果客戶送樣本DNA，要求：總量≥500 ng, 濃度≥20 ng/Μl, 純度：OD260/280=1.7-2.0。

 

Q7: 直接送樣本和送樣本DNA有什么特別需要注意的事項？

A:因為客戶提供的樣本則包括樣本或樣本DNA，所以微生物16S擴增子絕對定量測序提供的菌種拷貝數(shù)展現(xiàn)形式統(tǒng)一是：16S基因copies/ ng DNA，而常規(guī)的菌種qPCR絕對定量文章在菌種拷貝數(shù)的展現(xiàn)形式上則是：16S基因copies/ g樣本，因此為了將微生物16S擴增子絕對定量測序獲得的16S基因copies/ ng DNA值能夠?qū)?yīng)到 16S基因copies/ g 樣本上，需提前記錄好以下信息：

• 記錄抽提DNA時每個樣本所用量（？g 土壤/糞便），取樣時盡可能保證所有樣本取樣量一致，且DNA抽提條件完全一致；
• 記錄每個樣本抽提獲得DNA總量；

 

Q8: 為什么微生物16S擴增子絕對定量測序技術(shù)每個樣本有效序列≥15萬條？

A: 這是因為spike-in序列會占用掉一部分測序數(shù)據(jù)量，為了保證樣本常規(guī)的5萬有效reads數(shù)據(jù)量要求，每個樣本測序數(shù)據(jù)量需達15萬有效reads。

Q9: 微生物16S擴增子絕對定量測序技術(shù)和qPCR絕對定量技術(shù)對比如何？

A:

準(zhǔn)確度：我們比較qPCR絕對定量方法與16S擴增子絕對定量測序方法所測定的同一系列樣本的細菌總拷貝數(shù)，Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示：兩組數(shù)據(jù)在0.01水平上顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.955，且兩種方法計算的細菌總拷貝數(shù)值較為接近，未超過一個數(shù)量級，說明通過微生物16S擴增子絕對定量測序技術(shù)進行微生物絕對定量是可靠準(zhǔn)確的。

穩(wěn)定性：qPCR定量批次間及樣品重復(fù)間（批次內(nèi)）穩(wěn)定性較差，而16S擴增子絕對定量測序目前的項目結(jié)果顯示穩(wěn)定性相對較好。

特異性：16S擴增子絕對定量測序所用的引物是常規(guī)16s 擴增子測序最公認的引物，引物特異性很好，并且這一對引物就可以得到總細菌和所有菌種的絕對拷貝數(shù)；而特定菌種qPCR檢測則需要設(shè)計特定的引物，對引物特異性要求較高。

靈敏度：qPCR理論檢測靈敏度可以達到10¹分子，實際檢測中，有效靈敏度取決于標(biāo)準(zhǔn)曲線的菌種豐度下限，受qPCR檢測平臺和實驗方法的限制，通常檢測下限在10²水平。16S擴增子絕對定量測序理論檢測靈敏度為單分子，實際檢測中，有效靈敏度取決于標(biāo)準(zhǔn)曲線的菌種豐度下限，與添加的spike-in總拷貝關(guān)聯(lián)（添加10⁵拷貝：檢測下限為102拷貝，添加106拷貝：檢測下限為10³拷貝）。

 

Q10: spike-in序列的添加對樣本原有群落組成和樣本物種絕對豐度是否有影響？

A: 

• 以下是比較樣本A三次測序結(jié)果，三次測序編號分別為A_V4（未添加spike-in序列）、Y42_V4（添加10⁶ copies Spike-in序列）、Y4_V4（添加10⁷ copies Spike-in序列）。結(jié)果顯示：Y4_V4、Y42_V4、A_V4樣本優(yōu)勢菌屬完全一致，且這些菌屬在各個樣本中的相對豐度比較一致，說明spike-in的添加對樣本屬水平的群落組成無明顯影響。

 

圖1 屬（genus）水平群落組成柱狀圖

 

• 比較同一樣本中添加不同比例spike-in DNA測得物種絕對拷貝數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加17.4%和63.8% spike-in DNA對同一樣本的物種16S絕對拷貝數(shù)的計算值比較一致，說明添加spike-in對樣本中細菌進行絕對定量的方法重復(fù)性和穩(wěn)定性均較好，能夠真實定量出樣本中各個物種的絕對豐度。

 

圖2  優(yōu)勢OTU代表物種絕對拷貝數(shù)（Top 10 )

 

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