The ISME Journal：為什么微生物相對定量不能代替絕對定量

發(fā)稿時間：2018-12-04來源：天昊生物

英文題目: Absolute quantification of microbial taxon abundances

中文題目：微生物類群豐度的絕對定量

期刊名：The ISME Journal

影響因子： 9.520

發(fā)表時間：2017年

研究背景 :

基于標(biāo)記基因(如16S rRNA基因)的高通量擴增子測序技術(shù)已經(jīng)成為一種公認的微生物群落分析方法，這導(dǎo)致了該技術(shù)在縱向研究中的廣泛應(yīng)用。然而該測序技術(shù)的固有局限性只是計算微生物類群豐度的相對值。因此，我們必須謹(jǐn)慎對待這些相對豐度作出的相應(yīng)生物學(xué)解釋，這是因為這種測序技術(shù)忽略了樣本間總微生物絕對豐度的差異。據(jù)我們所知，目前還沒有相關(guān)研究來評估微生物相對豐度對真實微生物群落結(jié)構(gòu)造成的歪曲影響程度。在本研究中，我們結(jié)合使用流式細胞技術(shù)測量的細胞密度和16S擴增子測序得到的微生物相對豐度對冷卻水系統(tǒng)的中央蓄水池進行了兩次廣泛的縱向調(diào)查，我們量化了微生物類群的絕對豐度，并評估了其是否可以獲得額外的不同見解。

研究對象：

對在核試驗反應(yīng)堆上運行的二級冷卻水回路系統(tǒng)進行兩次40天調(diào)查（79個時間點），包括冷卻水系統(tǒng)沒有運行的時間段（control），冷卻水系統(tǒng)啟動階段（start-up），冷卻水系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)運行階段（operation）。

研究結(jié)果：

根據(jù)樣品的總細胞密度，計算每個時間點的每個微生物類群絕對豐度，每個微生物類群的細胞密度范圍是0.5-1679個細胞/μl。通過執(zhí)行相對豐度和絕對豐度之間的普通最小二乘回歸分析，幾個微生物類群間的差異變得明顯，我們關(guān)注其中三個最豐富的微生物類群，它們完全代表了群落中兩個截然不同的淡水分支（圖1）。我們發(fā)現(xiàn)OTU1(betI-A分支)和OTU2以及OTU3(bacI-A分支分類群)之間存在顯著差異，而OTU2和OTU3之間沒有顯著差異。這些結(jié)果表明不同微生物類群的相同相對豐度可能需要依賴于類群的生物學(xué)解釋，因為它們不一定具有相同的絕對豐度。

圖1對在核試驗反應(yīng)堆上運行的二級冷卻水回路進行兩次時間分離的40天調(diào)查（79個時間點）中3個最豐富OTUs的絕對豐度和相對豐度的散點圖

為了進一步驗證相對豐度的局限性，我們仔細檢查了兩個微生物分支的時間軌跡（圖2）。在解釋相對豐度和絕對豐度的時間軌跡時，可能檢測到兩個主要差異，如果結(jié)論僅基于相對豐度，則可能導(dǎo)致誤解：1）：在群落成長期間，比如survey 1的start-up和早期 operation階段，絕對豐度有一個明確的過渡，顯示出bacI-A分支的系統(tǒng)生長和衰變。相反，相對豐度分布則很模糊，在生長和衰變過程中，它們始終保持相對恒定，并且開始和結(jié)束非常明確，沒有任何過渡。2）：在survey2的operation后半部分可以觀察到相對豐度和絕對豐度的另一個顯著差異，相對豐度曲線顯示從±40%增加到90%以上，潛在地暗示了betI-A分支的選擇性生長，相反，如果看絕對豐度，那么這個分支就沒有明顯的活躍生長，其細胞密度從未顯著超過start-up階段結(jié)束時觀察到的最大密度。這種差異的原因可能是樣本中其它微生物類群的衰退從而導(dǎo)致其在群落結(jié)構(gòu)中相對豐度比例增長，但是同時環(huán)境卻限制了它絕對豐度的真實增長?？偟膩碚f，用絕對豐度曲線可以更精確地描述betI-A和bacI-A分支的動態(tài)變化。另外相對豐度比例和絕對豐度的相關(guān)性較差：只有一個OTU的相對豐度(OTU2)與總細胞密度顯著相關(guān),而整個群落組成的平均相關(guān)強度僅為-0.08±0.15(n=427)。

圖2對在核試驗反應(yīng)堆上運行的二級冷卻水回路進行兩次時間分離的40天調(diào)查期間，2個最豐富的微生物淡水分支(bacI-A(OTU2，紅色；OTU3，橙色)和betI-A(OTU1，藍色))的時間動態(tài)圖。top panel顯示從擴增子測序數(shù)據(jù)中推斷的相對豐度（in%），bottom panel顯示絕對OTU豐度（單位為細胞/μl）, 圓形標(biāo)簽表示微生物群落的總細胞密度（單位為細胞/μl±s.d）。最下方灰色區(qū)域表示冷卻水系統(tǒng)沒有運行的時間段（控制階段），綠色區(qū)域表示啟動，藍色區(qū)域表示穩(wěn)態(tài)運行。

研究結(jié)論：

1. 本文結(jié)合擴增子測序方法（16S rRNA基因）和單細胞計數(shù)技術(shù)（流式細胞術(shù)）來定量微生物分類單元的絕對豐度。使用絕對豐度的縱向分析導(dǎo)致產(chǎn)生與相對豐度顯著不同的豐度剖面，這些剖面很清楚，可直接用于比較研究。

2. 本文還提供了證據(jù)，證明微生物某一類群的富集（相對豐度比例的增加）不一定真正與相應(yīng)微生物類群的生長（絕對豐度的增加）有關(guān)，可能是其它微生物類群的衰退是導(dǎo)致其在群落結(jié)構(gòu)中相對豐度比例的增長。

3. 這些結(jié)果能夠表明，微生物類群的絕對定量是必不可少的，并且對微生態(tài)學(xué)內(nèi)許多懸而未決的問題具有進一步闡明的潛力。同時本文研究結(jié)果強調(diào)，對于微生物學(xué)調(diào)查的全面生物學(xué)解釋，應(yīng)該同時考慮絕對豐富度，而不能僅僅考慮微生物的相對豐度。