Greenleaf教授最新Nature Reviews文章：染色質可及性和調控表觀組學

發(fā)稿時間：2019-02-02來源：天昊生物

Stanford大學William Greenleaf教授，ATAC-seq領域開創(chuàng)者之一

個人主頁：http://greenleaf.stanford.edu/index.html

雖然名字叫“Greenleaf (綠葉)”，但是William Greenleaf教授在表觀調控研究領域，絕對是“紅花”級人物。自該課題組在2013年Nature Methods上發(fā)表第一篇ATAC-seq (assay for transposase-accessible chromatin using sequencing)技術性文章(Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position)以來，有關染色質開放程度及表觀調控相關的研究就火了起來。Greenleaf教授于2019年1月在Nature Reviews Genetics上發(fā)表了綜述性文章，系統(tǒng)總結了染色質可及性和調控表觀組學研究進展。

DNA的物理可接近是染色質高度動態(tài)過程，在建立和維持細胞特征方面發(fā)揮著重要作用?；蚪M可接近染色質的組織形式反映了可能的物理性相互作用網絡。在這個網絡中，增強子、啟動子、絕緣體和染色質結合因子共同作用，調節(jié)基因表達。這種可及性情況會隨著外部刺激和發(fā)育的變化而動態(tài)變化。新的證據表明，可及性的穩(wěn)態(tài)維持本身是通過染色質結合因子和核小體之間的競爭相互作用來動態(tài)調節(jié)的。在這篇綜述中，作者總結了如何檢測可接近基因組方法，并探索轉錄因子在啟動可接近性重塑中的作用；本文目標是闡明染色質可及性如何詮釋基因組中的調控元件，并探討這些表觀遺傳學特征如何動態(tài)建立并控制基因表達的。

名詞解釋：

Chromatin-binding factors: Non-histone macromolecules that bind either directly or indirectly to DNA.

Transcription factor (TF): A non-histone protein that directly binds to DNA.

Architectural proteins: Proteins that have a structural role in organizing chromatin, including linker and core histone proteins, as well as insulator proteins.

Nucleosome occupancy: The fraction of time that a particular sequence of DNA is bound by the core histone octamer.

Epigenetic canalization: A set of persistent epigenetic features (alternatively, the process of establishing this feature set) that molecularly defines a cell type and comprises a continuum of cellular states including cell cycle phases and active

tion states.

TF footprinting: High-resolution analysis of chromatin accessibility data to identify a local accessibility signature in the neighborhood of putative binding sites for a particular transcription factor (TF). This signature reflects the size and binding mechanism, as well as other biophysical properties, of a TF.

Nucleosome turnover rates: The rates at which nucleosomes disassemble at particular genomic loci; alternatively, the inverse of the nucleosome residence times.

Poised enhancers: Inactive enhancers that do not regulate gene expression but share a subset of epigenetic features commonly observed at active enhancers, including histone H3 lysine 4 monomethylation (H3K4me) and accessibility.

圖1、可接近狀態(tài)反映基因組中染色質動態(tài)的分布。與封閉染色質（closed chromatin）相反，寬松染色質（permissive chromatin）對于轉錄因子來說是足夠動態(tài)的，可以啟動序列特異性的可及性重塑并建立開放染色質（open chromatin）構象。Pol II：核糖核酸聚合酶II；TF：轉錄因子。

染色質可及性（Chromatin accessibility）是核內大分子能夠物理接觸染色質化DNA的程度，由核小體的占據和拓撲結構以及阻礙DNA可及性的其他染色質結合因子決定（圖1）。雖然可接近的基因組占總DNA序列的約2-3%，但卻含有90%以上TFs的結合區(qū)域。TFs與組蛋白和其他染色質結合蛋白動態(tài)競爭，以調節(jié)核小體占據率并促進對局部DNA的接近。染色質可及性反映了TF結合和遺傳位點總的調節(jié)潛力。這種觀點為追蹤決定細胞狀態(tài)的轉錄調控因子差異結合的可及性變化奠定了分析基礎。

檢測染色質可及性常用方法

最近的技術進步極大地拓寬了染色質可及性檢測的應用范圍，將樣本需求降低到臨床的水平，并提高了這些分析的鑒定能力，以識別單細胞和單分子分辨率下的調控結構域（圖2）。

圖2、檢測染色質可及性的主要方法。a）DNase-seq：脫氧核糖核酸酶I超敏位點測序(DNase I hypersensitive site sequencing)，使用內切脫氧核糖核酸酶在可接近的染色質內切割DNA。內切核酸酶在蛋白質結合位點切割效果被大大削弱(紅色十字表示切割阻斷)。b）ATAC-seq：轉座酶可及染色質測序（Assay for transposase-accessible chromatin using sequencing），使用超活性轉座酶(Tn5)同時切割并將adaptors連接到可及DNA上并測序。c）MNase-seq：微球菌核酸酶測序(Micrococcal nuclease sequencing)，使用內切核酸酶/外切酶MNase切割和除去可接近的DNA并測序。d）NOMe-seq：核小體定位及甲基化組測序(Nucleosome occupancy and methylome sequencing)，使用GpC甲基轉移酶來甲基化可接近的DNA。亞硫酸氫鹽將非甲基化胞嘧啶轉化為尿嘧啶核苷酸后的DNA并測序。

DNase-seq：利用DNase切割之后測序的方法來量化基因組中DNase敏感染色質的相對豐度?？梢允褂肐I型酶進行單次切割后進行建庫測序的，也有使用雙次切割后選擇合適大小片段建庫測序。單次切割方法可以識別更容易接近的位置，而雙次切割工作流程更簡單，可以得到更高信噪比數(shù)據（圖2a）。

ATAC-seq：利用超活性轉座酶Tn5切割染色染后測序。目前ATAC-seq已經被廣泛采用，重要原因是該方法技術穩(wěn)定性好，操作簡單快速，并且適用于臨床和初級組織等樣本有限的情況。ATAC-seq文庫通?？梢栽诓坏?小時內可以用10000-20000個細胞（已有報道使用少至500個細胞）構建；相比之下，DNase-seq通常需要數(shù)十萬個細胞和幾天才能完成。

MNase-seq：利用微球菌核酸酶MNase來切割并測序。該技術可以鑒定組蛋白在調控染色質可及性中的作用。MNase既可以利用內切酶活性切割核小體間DNA，也作為外切酶活性降解未受蛋白質保護的切割產物DNA。

NOMe-seq：利用來自M.CviPI的GpC甲基轉移酶MTase，通過化學修飾而不是切割可接近的DNA來探測染色質可接近性。由于該酶可以對不受核小體或與染色質緊密結合的其他蛋白質保護的GpC二核苷酸(GpC^m不出現(xiàn)在人類基因組中，因此沒有GpC^m的內源性背景)在GC處產生特異甲基化。由于在整個基因組中GpC的頻率很高，因此NOMe-seq可以同時檢測DNA的可及性和甲基化狀態(tài)，且不存在富集偏差和單分子特征。

單細胞可及性方法

單細胞可及性變化的測量有望揭示基因組調控的一個核心問題：短時間波動和染色質可及性的發(fā)育變化是如何在整個基因組中協(xié)調的？基于ATAC-seq、DNase-seq和NOMe-seq文庫制備方案，已經開發(fā)了多種方法來測量單細胞染色質可及性。

組合式標簽為成千上萬個單細胞ATAC-seq的建庫提供了一種優(yōu)秀的條形碼策略。在這種方法中，用獨特的條形碼Tn5酶對純化的細胞核進行多次轉座反應，然后在有限稀釋度下混合進行多重標簽PCR反應。

單細胞ATAC-seq可以通過捕獲單細胞微流體裝置(Fluidigm，C1)或納米孔芯片(Takara Bio，ICELL8)來實現(xiàn)。最近，單細胞ATAC-seq也已經在10X Genomics和Bio-Rad的基于液滴的微流體平臺上實現(xiàn)。早期的報告表明，這些高通量平臺將提供與納米孔捕獲技術類似的數(shù)據質量。

染色質可及性圖譜解讀

最近對單分子和單細胞可及性的檢測表明，對細胞群體的可及性檢測代表不同分子狀態(tài)的整體平均值(圖3)。當觀察一個潛在的、動態(tài)的、不同步的過程時，這種分子異質性自然會出現(xiàn)。例如，在轉錄位點，RNA聚合酶及其他TF一起，置換TSS上游的核小體，并移動啟動子下游位置良好但不穩(wěn)定的核小體(圖3a )。對單分子NOMe-seq數(shù)據的足跡分析揭示了這一過程，隨著轉錄過程的展開，捕捉每個分子狀態(tài)(圖3b)。盡管會受采樣效率的影響，但是單細胞可及性檢測與對整個基因組調節(jié)區(qū)域的預測得到相似的分子異質性結果(圖3c)。

圖3、染色質可及性的群體尺度測量反映了單分子異質集合的平均可及性。a）轉錄活性啟動子和基因主體的可及性表明異質分子構型的集合決定了群體染色質可及性分布。b）轉錄起始位點(TSSs)可及性的單分子測量反映了結合蛋白對DNA的不同保護作用。c）單細胞ATAC-seq測量持家基因位點的可及性，顯示DNA對轉座酶切的異質敏感性。

染色質可及性最近被用來鑒定全基因組關聯(lián)研究(GWAS)產生的因果遺傳變異。人類基因組中的大多數(shù)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)出現(xiàn)在非編碼和基因間的基因組區(qū)域，并對復雜性狀單獨產生小的或間接的影響，從而影響因果變異檢測。最近，一些研究利用染色質可及性來更好地理解這些非編碼SNPs及其對性狀的影響。例如，Maurano等人研究表明，許多因果GWAS變異集中在非編碼DHSs（DNase hypersensitivity sites）中，并且可以通過使用染色質可及性數(shù)據更準確地與它們影響的基因聯(lián)系起來。這些結果強調了將染色質可及性數(shù)據與功能和其他表觀遺傳學數(shù)據分析相結合的價值。

可及性的生物物理決定因素

在真核生物基因組中，對染色質化DNA的物理接觸受到不同長度尺度的調控，并且很大程度上取決于核小體和DNA相關大分子的組織和占據，包括TFs和結構蛋白。DNA幾乎普遍被組蛋白或其他DNA結合因子結合，盡管這些因子在TF長度尺度上局部阻斷DNA結合，但非抑制因子對DNA的競爭往往會增加核小體長度尺度上的可及性。TF結合與可及性相關的原因可能是多種原因造成的。首先，包括TFs和聚合酶等DNA結合蛋白的足跡通常遠小于核小體占據的約146 bp。因此，與完整核小體相比，非組蛋白結合使DNA更容易接近。第二，分子間的相互作用基本上是隨機的，非組蛋白與DNA復合物的平均停留時間通常比核小體周轉的時間更短，因此可以更頻繁地接觸未結合的DNA。最后，序列依賴性結合蛋白與DNA的非特異性染色質重塑提供了一種補充底物，這種重塑通常通過去除或重新定位核小體來進一步打開近端染色質?？紤]到這些因素，組蛋白的線性和拓撲結構在啟動DNA獲取方面都有著巨大的作用。

圖4、核小體周轉率和占據率在大尺度基因組區(qū)域內呈反比關系。易接近的染色質在高核小體周轉率的基因組區(qū)域內富集，也與密集核小體占據一致。

染色質可及性重塑

對染色質化DNA的物理接觸是隨著外部刺激和發(fā)育階段而動態(tài)變化的。染色質的可及性在整個基因組中受到多種因素調控。TFs在這一過程中必然起著中心組織作用，因為重塑機制的其他組成部分很大程度上不提供DNA序列特異性。然而，絕大多數(shù)被檢測的TFs只與可接近的核小體耗盡的DNA結合；這種生物物理限制的典型例子是熱休克因子，在核心組蛋白存在的情況下，熱休克因子不能結合到它的同源DNA靶上，而是依賴于熱休克啟動子無處不在的可及性來快速誘導反應基因。因此，TFs如何與封閉染色質相互作用以提供序列特異性可及性重塑的機制問題仍然是一個深入研究的課題。這里研究者提出幾個工作模型解釋了TFs和活躍核小體重塑子的協(xié)同作用是如何建立和維持可及性狀態(tài)的(圖5)。

圖5、染色質可及性重塑模型。a）轉錄因子(TFs)通過與動態(tài)核小體(以淺灰色顯示)的被動競爭引發(fā)可及性重塑。核小體的周轉動力學受局部DNA序列、組蛋白組成和特定染色質重塑子(CR)活性的調節(jié)。TF結合位點的被動競爭可能涉及核小體滑動或驅逐。b）與活性染色質重塑子一起，TFs置換瞬時結合到非核小體模板上的結構蛋白(APs)，以啟動順式核小體驅逐?；钚院诵◇w位移通過與新獲得的DNA結合的次級轉移因子來穩(wěn)定。c）激活的TF與組成性可獲得的增強子結合，并通過招募活躍的染色質重塑子和穩(wěn)定次級TFs (SFs)來介導核小體驅逐和可及性重塑。d）先鋒轉錄因子與核小體DNA結合，并獨立或與活躍的染色質重塑子一起直接打開染色質。核小體驅逐后次級TFs的結合穩(wěn)定了新建立的可及性狀態(tài)。

結論和未來發(fā)展方向

染色質可及性是通過組蛋白、TFs和活性染色質重塑者之間的動態(tài)相互作用建立的。核小體的占有和定位是可及性的主要決定因素，并受到序列特異性TFs和染色質重塑子的調控。這種相互作用是通過亞組蛋白規(guī)模的TFs對核小體DNA的直接競爭或者通過招募活躍的染色質重塑子來動態(tài)驅逐核小體來實現(xiàn)的。核小體不僅僅是一個壓抑的單位，而是染色質調控景觀的中心組成部分。未來幾年，新的單分子和單細胞方法將會揭示這一模式的生物物理和功能含義。

染色質狀態(tài)和功能之間存在著復雜的相互作用，一個例子涉及增強子和啟動子可及性的轉錄影響；盡管兩者對于轉錄都是必需的，并與活性相關，但轉錄沉默基因的非活性增強子和啟動子通常是開放的，這表明染色質可及性對于增強子或啟動子活性是必需單不充分的。這些穩(wěn)定的增強子和啟動子是可接近的，但缺乏活性調節(jié)區(qū)的明確標記，包括增強子RNA (eRNA )生成和組蛋白乙?；?。另一個可及性和轉錄活性不一致的例子是在發(fā)育中的黑腹果蠅的合子基因激活期間：盡管激活前在早期胚胎中觀察到染色質的廣泛開放，但是許多可及性基因在轉錄上是不活躍的，直到發(fā)育后期。

直到最近，由于大量的材料需求，臨床樣本在很大程度上難以進行表觀遺傳學分析。然而，小規(guī)模染色質可及性分析的進展預示著廣泛的臨床影響，特別是對于理解復雜的疾病狀態(tài)，如造血致癌和免疫衰竭。最近對皮膚T細胞淋巴瘤的研究揭示了癌基因失調的易接近性特征和治療干預的表觀遺傳學含義。整合單細胞表觀遺傳學和轉錄測量，包括最近關于單細胞轉錄和染色質可及性測量的報告，將進一步拓寬人們對疾病表觀遺傳學基礎的理解和表觀基因組學的臨床應用空間。

染色質可及性代表了表觀基因組的功能，定義了整個基因組中一系列假定的調控區(qū)域。增強子、絕緣體、啟動子和基因體之間開放染色質的組織提供了一個可延展的生物物理模板，染色質表觀基因組的成分通過該模板相互作用。了解這些調控域是如何隨著細胞在發(fā)育階段和細胞激活狀態(tài)之間的轉變而動態(tài)建立的，以及調控元件如何塑造基因表達程序的生物物理規(guī)則，將是未來幾年表觀遺傳學研究的一個重要焦點。

原文網址：https://www.nature.com/articles/s41576-018-0089-8

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