多細胞生物中不同細胞類型和細胞特異性功能的產(chǎn)生，很大程度上是基因表達差異的結(jié)果。單細胞RNA測序(scRNA-seq)方法的發(fā)展，已經(jīng)徹底改變了我們對單個細胞內(nèi)部和之間基因表達的理解。隨著單細胞RNA測序商用平臺，特別是10X Genomics的推廣應(yīng)用及生信分析方法的不斷完善，研究者只要利用好手里的特色樣本（例如動植物特有物種或者突變體等組織樣本），通過天昊生物提供的10X Genomics細胞分選系統(tǒng)+高通量測序一站式服務(wù)，就可以在單細胞水平高效的分析轉(zhuǎn)錄組情況，快速占領(lǐng)單細胞研究領(lǐng)域的前沿高地。下面就跟大家分享兩篇在植物和動物單細胞RNA測序方面的最新研究進展。

1、Single-cell RNA sequencing resolves molecular relationships among individual plant cells

題目：單細胞RNA測序解析單個植物細胞之間的分子關(guān)系

單細胞RNA測序(scRNA-seq)已廣泛用于研究動物細胞特異性基因表達，但尚未廣泛應(yīng)用于植物。本研究報道了一種基于商用液滴微流體平臺（10X Genomics）的高通量scRNA-seq方法，從超過10000個擬南芥根細胞原生質(zhì)體中獲得單細胞轉(zhuǎn)錄組。研究發(fā)現(xiàn)，所有主要組織和發(fā)育階段都存在于這種單細胞轉(zhuǎn)錄組群體中。此外，還鑒定了不同的亞群和稀有細胞類型，包括可能的靜態(tài)中心細胞。根表皮細胞轉(zhuǎn)錄組的集中分析定義了從分生組織到根毛和非毛細胞分化成熟階段的各個細胞的發(fā)展軌跡。此外，單細胞轉(zhuǎn)錄組是從根表皮突變體中獲得的，能夠以單細胞分辨率對基因表達進行比較分析，并對突變基因的影響提供了前所未有的視角。總的來說，這項研究證明了scRNA-seq在植物中的可行性和實用性，并提供了單細胞分辨率下擬南芥根的第一代基因表達圖譜。

實驗材料及結(jié)果

擬南芥根尖單細胞轉(zhuǎn)錄組分析

本研究使用10X Genomics Chromium平臺從野生型擬南芥根尖原生質(zhì)體的三個生物學重復中獲得總共7522個單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(圖1A)。每個細胞平均獲得了大約75000條reads及5000個表達的基因，所有細胞群體中檢測到的總基因共計22000多個。

通過繪制單細胞轉(zhuǎn)錄組t分布隨機鄰域嵌入(tSNE)圖，發(fā)現(xiàn)從每個生物重復樣本產(chǎn)生了大量重疊的細胞分布，表明重復結(jié)果具有高度的再現(xiàn)性(圖1B)。使用Seurat無監(jiān)督聚類方法得到九個主要的細胞轉(zhuǎn)錄組聚類簇(圖1C)。研究人員還根據(jù)在特定根組織/細胞類型中表達的86個標記基因的表達，生成整個細胞群體中所有標記基因的轉(zhuǎn)錄組合圖(圖1D)，以及每個標記基因的轉(zhuǎn)錄表達圖(圖1E和F)。總的來說，這一分析展示了特定細胞群被分配到中柱組織(群0和5)、根毛表皮細胞(4和8)、非毛表皮細胞(3)、皮層(6)、內(nèi)皮層(7)、分生組織內(nèi)皮層(2)和根冠(1) (圖1G)。這表明scRNA-seq成功地得到了代表所有主要根尖組織類型的細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。

圖1、野生型擬南芥根單細胞轉(zhuǎn)錄組的分離和聚類分析

接下來研究者對組織內(nèi)特定細胞類型相對應(yīng)的主要簇內(nèi)的細胞亞簇進行了識別，主要集中在中柱細胞分析上。通過使用韌皮部或木質(zhì)部內(nèi)特定細胞類型的特異性標記基因，包括原韌皮部篩細胞、韌皮部伴細胞和原木質(zhì)部細胞，并在代表這些細胞類型的相應(yīng)韌皮部或木質(zhì)部簇中發(fā)現(xiàn)了相對較小的亞簇(圖2)。這些結(jié)果表明，單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集足以識別不同的和相對稀少的細胞亞型。

圖2、通過tSNE投影圖上的中柱標記基因表達情況來識別中柱中不同細胞類型的簇。顏色強度表示每個細胞中指定基因的相對轉(zhuǎn)錄水平。

對于一些基因來說，轉(zhuǎn)錄水平在單個簇的細胞中有所不同，這表明基因表達存在潛在的發(fā)育梯度。例如，SCR在薄壁組織(分生組織內(nèi)皮層)簇的一端優(yōu)先轉(zhuǎn)錄(圖3A)，而UBP1主要在分化根細胞的伸長階段表達，表現(xiàn)出多個簇細胞差異轉(zhuǎn)錄本積累(圖3B)。研究者分析了在分生區(qū)或分化區(qū)優(yōu)先表達的基因，確定了在群體中每個細胞中表達的分生基因與分化基因的比率，獲得所有細胞分化狀態(tài)圖譜，揭示了最不成熟(即分生組織)的細胞位于tSNE的中心，逐漸向外部分化的細胞發(fā)散(圖3C)。

圖3、基因表達在簇內(nèi)的發(fā)育變化

表皮和靜態(tài)中心細胞分析

本研究將代表表皮組織和發(fā)育相關(guān)根冠組織的單細胞轉(zhuǎn)錄組(圖1C中的簇1、3、4和8)重新聚類，產(chǎn)生11個較小的細胞簇(圖4A)。通過分析這些簇中差異表達的基因和根表皮和根冠的43個標記基因的轉(zhuǎn)錄積累(圖4B)，定義了代表根毛細胞(簇1、2、3)、非毛細胞(簇0、8、9)和小柱根冠細胞(簇10)的簇。為了描述基因在表皮細胞中的表達模式，研究者首先分析了前人報道的根毛基因和52個先非毛基因的表達。分別跨越根毛簇和非毛簇中的細胞(圖4C和D)。這些熱圖顯示了細胞分化過程中不同基因表達波動。

有趣的是，最不成熟根毛和非毛表皮細胞的簇(簇2和簇9)由簇7連接，這暗示簇7中的兩種表皮細胞類型有一個共同的發(fā)育起點。研究者通過擬時軌跡分析，推斷了根毛細胞和非毛細胞的發(fā)育軌跡 (圖4E和F)及R的Destiny包擴展映射圖(圖4G)，并用實驗檢測了幾種已知的根毛細胞分化早期標記物(MYC1、EGL3和RHD6)和非毛細胞分化早期標記物(TTG2、GL2和ETC1)的轉(zhuǎn)錄積累，發(fā)現(xiàn)表達這些早期標記物的細胞起源于簇7 (圖4H)。

圖4、根表皮和根冠組織單細胞轉(zhuǎn)錄組分析

為了進一步探討表皮細胞的起源，根據(jù)各個細胞內(nèi)早期根毛細胞調(diào)節(jié)子(MY1、EGL3和RHD6)和非毛細胞調(diào)節(jié)子(TTG2、GL2和ETC1)基因表達的重疊程度，發(fā)現(xiàn)簇7中的大部分細胞表達至少一個根毛標記基因和一個非根毛標記基因(圖5A)，這意味著這些細胞某種程度的細胞命運不穩(wěn)定，可能代表表皮細胞譜系的起源。

靜態(tài)中心(QC)細胞位于擬南芥根分生組織中的根表皮干細胞附近。利用52個已知的QC表達標記基因，研究者發(fā)現(xiàn)簇7下部的相對小的一組細胞始終表現(xiàn)出QC標記表達(圖5B)，鑒定了兩個表現(xiàn)出最大程度QC標記基因表達的細胞(圖5C)，并鑒定了在2個假定的QC細胞中表達但在其他21個細胞中沒有表達的6個基因，在分析了它們在所有單細胞轉(zhuǎn)錄組中的轉(zhuǎn)錄累積后，發(fā)現(xiàn)其中一個基因(AT2G39220或PLP6 )基本是QC特異性的(圖5D)。這些結(jié)果表明， scRNA-seq數(shù)據(jù)集能夠識別代表稀少群體的細胞轉(zhuǎn)錄組。

圖5、靜態(tài)中心( QC )細胞的鑒定

rhd6和gl2根表皮突變體的單細胞分析

接下來，本研究探討了scRNA-seq在單細胞分辨率下分析突變體表型的應(yīng)用。使用rhd6突變體和gl2突變體根原生質(zhì)體進行單細胞轉(zhuǎn)錄組檢測，rhd6突變體基本上缺少根毛細胞，gl2突變體缺少非毛細胞。將這些單細胞轉(zhuǎn)錄組與野生型細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)放在一起分析，得到12個主要簇(圖6A和B)。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)位于根毛細胞群中的rhd6細胞轉(zhuǎn)錄組的比例顯著下降，非毛細胞群中gl2細胞轉(zhuǎn)錄組的比例也降低 (圖6C)。然后使用單細胞轉(zhuǎn)錄組來分析rhd6和gl2突變體中異常表皮細胞的特征。通過檢查在相對早期啟動表達的根毛標記基因，研究者檢測到rhd6轉(zhuǎn)錄組中的非毛細胞群體不正常地表達這些早期根毛細胞標記。類似地，也檢測到表達早期非毛發(fā)標記基因的gl2細胞轉(zhuǎn)錄組的群體。這些發(fā)現(xiàn)表明，一些rhd6和gl2突變表皮細胞分別保留了表達毛發(fā)細胞基因和非毛發(fā)細胞基因的能力，這意味著這些突變不會阻斷所有毛發(fā)/非毛發(fā)途徑基因的表達，因此不會完全將一種表皮細胞類型轉(zhuǎn)化為另一種。這也再次證明了scRNA-seq數(shù)據(jù)在確定細胞亞群和以單細胞分辨率表征突變表型方面的有效性。

圖6、野生型和根表皮突變體單細胞轉(zhuǎn)錄組比較結(jié)果

2、Single-cell transcriptome provides novel insights into antler stem cells,a cell type capable of mammalian organ regeneration

題目：單細胞轉(zhuǎn)錄組為鹿茸干細胞這類可使哺乳動物器官再生的細胞提供新的見解

鹿角再生是一種基于干細胞的表面再生過程，有潛力成為再生醫(yī)學的一個有價值的模型。用于鹿茸發(fā)育的鹿茸干細胞庫位于鹿茸骨膜中。然而，這個ASC庫是同質(zhì)的還是異質(zhì)的還并不十分清楚。在本文中，研究者首次使用10X Genomics平臺，通過單細胞轉(zhuǎn)錄組測序方法(scRNA-seq)對鹿茸干細胞進行了測定。共有4565個鹿茸干細胞被測序并組成一個大的細胞群，這表明在AP的ASC可能是一個同質(zhì)群體。scRNA-seq數(shù)據(jù)顯示，腫瘤相關(guān)基因在這些同質(zhì)ASCs中高度表達。對干細胞標記物的篩選結(jié)果表明，干細胞可能被認為是胚胎干細胞(CD9)和成體干細胞(CD29、CD90、NPM1和VIM)之間的一種特殊類型的干細胞。本研究結(jié)果第一次在單細胞水平上對鹿茸干細胞轉(zhuǎn)錄組進行了綜合分析，并且只鑒定出了鹿茸骨膜中的一種主要細胞類型和一些關(guān)鍵的干細胞基因，這可能是為什么鹿角這種獨特的哺乳動物器官一旦丟失就能完全再生的關(guān)鍵。

實驗材料及結(jié)果

本研究通過對鹿茸骨膜（AP）細胞的分離，獲得含有約7500個細胞的細胞懸浮液，利用10X Genomics平臺標準的細胞分選流程及后續(xù)高通量測序，完成單細胞轉(zhuǎn)錄組檢測。

高質(zhì)量scRNA-seq數(shù)據(jù)的獲得

實驗共獲得252818309個reads被映射到14993個基因上，這些基因在4731個鹿茸干細胞（ASCs）中表達。條形碼UMI計數(shù)曲線的急劇下降，表明細胞相關(guān)條形碼與空液滴的良好分離(圖1a)。通過基因數(shù)量(圖1b)和線粒體基因的百分比(圖1c)相對于每個細胞相應(yīng)UMI數(shù)結(jié)果，排除異常潛在的多細胞小液滴，最終共保留了4615個單細胞和13173個基因用于后續(xù)分析。

圖1、使用10X Genomics對ASC單細胞轉(zhuǎn)錄組測序的質(zhì)控結(jié)果

ASC大細胞聚類群

基于不依賴已知標記的最近鄰域類算法，從4615個高質(zhì)量細胞中得到兩個細胞簇(圖2a)。進一步根據(jù)基因表達將這些細胞分成兩個不同的細胞群(圖2b)。研究者在小簇(50個細胞)中沒有發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因。然而，大量下調(diào)的線粒體基因被表達，這強烈表明小簇可能被ASCs碎片污染。發(fā)現(xiàn)大細胞群( 4565個細胞)中的ASCs表達高水平的細胞外基質(zhì)蛋白，如膠原蛋白家族，這些基因通常被用于測量從間充質(zhì)干細胞到成骨細胞、骨祖細胞和軟骨基因增生的分化狀態(tài)?；?/span>0.2的更高分辨率，大細胞群又可被分成兩個群，分別有2404個和2161個細胞(圖2c)，但是只有四個基因的絕對對數(shù)具有2倍變化值(圖2d)，表明AP中的ASC群體可能代表相似群體。

圖2、基于無監(jiān)督圖的ASCs t-SNE分析

ASCs中高表達基因

總共有35個基因被發(fā)現(xiàn)在大細胞群的細胞中高表達，基于它們的表達水平對它們進行進一步分類(圖3a)。使用免疫熒光染色進一步證實TMSB10、LGALS1 (圖3b)和VIM (圖4a ) 蛋白的高表達。在所選的35個基因中，25個被發(fā)現(xiàn)參與了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖3c)，這表明它們可能會聚集在一起以適應(yīng)ASCs中的特定生物功能。

圖3、scRNA-seq中高表達基因驗證及分析

干細胞標志物的表達

為了研究干細胞標志物在大細胞群中的表達狀況，研究者基于兩個標準從scRNA-seq數(shù)據(jù)中選擇了16個標志物基因：(1)在至少一個UMI計數(shù)中表達，(2)在超過3 %的ASCs中表達。這16種標記基因隨后根據(jù)文獻中每種類型的定義，被分成四種類型的干細胞標記：間充質(zhì)干細胞標記、胚胎干細胞標記、神經(jīng)干細胞標記物和癌癥干細胞標志物 (圖4a)。當表達水平設(shè)定為nUMI>5時，發(fā)現(xiàn)超過40 %的ASCs中表達了四種間充質(zhì)(CD90、CD29、VIM和NPM1)和一種胚胎干細胞標記基因(CD9) (圖4b)。

圖4、使用干細胞標記物的ASC篩選結(jié)果

使用免疫熒光染色進一步證實了這五種干細胞標基因的高表達水平(圖5a)。為了進一步調(diào)查這五個標記基因中每一個的陽性細胞比例，進行流式細胞FACS多色分析，結(jié)果顯示CD9+、CD90+、CD29+、VIM+和NPM1+分別在91.1 %、93.2 %、92.8 %、98.4 %和94.5 %的ASCs中呈陽性(圖5b)，這與scRNA-seq數(shù)據(jù)分析的結(jié)果一致。

圖5、血管平滑肌細胞免疫染色和流式細胞儀分析

關(guān)于天昊

天昊生物具有多年基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀組檢測與分析經(jīng)驗，現(xiàn)推出的10x單細胞轉(zhuǎn)錄組測序可為您提供專業(yè)便捷的科研服務(wù)及個性化的單細胞信息挖掘，期待成為您單細胞測序分析的優(yōu)質(zhì)服務(wù)提供商！

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