單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在跨物種（人、大鼠、小鼠、豬）腎內(nèi)細(xì)胞基因表達(dá)特征鑒定中的應(yīng)用

發(fā)稿時(shí)間：2019-05-27來源：天昊生物

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（scRNA-seq）技術(shù)在不同物種、不同組織及發(fā)育階段中的應(yīng)用越來越廣泛，今天就跟大家分享一篇?jiǎng)倓傇趪?guó)際頂級(jí)腎臟病學(xué)期刊《Journal of the American Society of Nephrology》發(fā)表的研究論文，該文章用到了10x Genomics平臺(tái)探討不同物種間（人、大鼠、小鼠、豬）腎內(nèi)常駐巨噬細(xì)胞基因表達(dá)的特征。

 

Single-Cell RNA Sequencing Identifies Candidate Renal Resident Macrophage Gene Expression Signatures across Species

題目：單細(xì)胞RNA測(cè)序鑒定跨物種腎內(nèi)常駐巨噬細(xì)胞候選基因表達(dá)特征

發(fā)表雜志：J Am Soc Nephrol 影響因子：8.655  發(fā)表日期：2019-5

 

 

 

研究背景：

常駐巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)包括腎臟在內(nèi)的多種組織的穩(wěn)態(tài)和疾病過程。盡管有明確的標(biāo)記來識(shí)別小鼠中的這些細(xì)胞，但技術(shù)限制阻止了不同物種間相似細(xì)胞類型的識(shí)別。無法識(shí)別跨物種的常駐巨噬細(xì)胞群阻礙了從動(dòng)物模型獲得的數(shù)據(jù)向人類患者的轉(zhuǎn)化。本研究以小鼠、大鼠、豬和人腎組織中所有除去T細(xì)胞和B細(xì)胞的CD45⁺先天免疫細(xì)胞scRNAseq分析為切入點(diǎn)，確定能夠跨物種識(shí)別常駐巨噬細(xì)胞的新標(biāo)記。

實(shí)驗(yàn)材料及方法：

單細(xì)胞獲得

小鼠：取8周大C57BL/6野生型雄性小鼠腎臟，用無菌刀片切碎(約0.15克)，并在37℃酶液消化30分鐘。10x Genomics實(shí)驗(yàn)中，3只野生型雄性小鼠腎臟樣本合并后用于測(cè)序。

大鼠：取3個(gè)月大的雄性Sprague–Dawley大鼠腎臟，稱取約2.5 g含有皮質(zhì)和髓質(zhì)的腎組織。用無菌刀片將腎切碎，在37℃用酶液消化30分鐘。

豬：取6個(gè)月大的雄性豬腎臟。稱取約2.5 g含有皮質(zhì)和髓質(zhì)的腎組織。用無菌刀片將腎切碎，并在37℃用酶液消化30分鐘。

人：在切除后4小時(shí)內(nèi)從外科腎切除術(shù)中收集殘余的人腎組織。對(duì)于scRNAseq，從一名60歲白人男性獲得正常腎組織，其血清肌酐(0.8-1.2 mg/dl)正常，有外生性3厘米病變。在3名成年患者(平均年齡63 ± 8歲，兩名男性和一名女性，兩名白人和一名黑人)的相對(duì)未受影響的腎組織上驗(yàn)證了由scRNAseq鑒定的標(biāo)記。腎組織用無菌刀刀片將2.5 g含有皮質(zhì)和髓質(zhì)的組織切碎，并在37℃下酶液消化30分鐘。

消化后，腎臟碎片通過70微米過濾器，獲得單細(xì)胞懸浮液。細(xì)胞用溶液重懸，在室溫下用相應(yīng)抗體染色30分鐘，小鼠：PE rat anti-mouse CD45，BV786 hamster anti-mouse CD3e和PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse B220；大鼠：PE anti-rat CD45，APC anti-rat CD3和PE/Cy7 anti-rat CD45RA；豬：mouse anti-pig CD45和Fitc mouse anti-human CD3e，第二抗體包括Cy5 donkey anti-mouse IgG；人：Pacific Blue anti-human CD45，BV605 anti-human CD3和Alexa Fluor 647 anti-human CD19。所有物種都用Fixable Aqua Dead Cell Stain染色。加入一級(jí)抗體后，將細(xì)胞離心，在0.04% BSA中洗滌，再懸浮在1毫升0.04% BSA中。樣本被采集到流式細(xì)胞儀中，并使用Becton-Dickenson FACSAriaII進(jìn)行分選。

Fluidigm C1測(cè)序

Fluidigm單細(xì)胞cDNA文庫制備。簡(jiǎn)單地，F(xiàn)ACS分選后的巨噬細(xì)胞在Dulbecco-PBS中重新懸浮至最終濃度為300-350細(xì)胞/毫升，并與Fluidigm懸浮試劑混合，達(dá)到55%的最終浮力，這由預(yù)試驗(yàn)確定。將6微升混合細(xì)胞裝載到Fluidigm C1 IFC平板中(10-17微米捕獲位點(diǎn))，用于mRNA序列。捕獲的單細(xì)胞通過顯微鏡進(jìn)行確認(rèn)。接下來，裂解混合物、反轉(zhuǎn)錄混合物和預(yù)擴(kuò)增混合物，最終構(gòu)建的文庫由Illumina Nextseq上測(cè)序。

10x Genomics

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法制備10x Chromium單細(xì)胞文庫。簡(jiǎn)單地，F(xiàn)ACS分選的單細(xì)胞懸浮液、10x條形碼凝膠珠和油被裝載到Chip中，通過Chromium Controller捕獲凝膠珠乳液(GEMs)。全長(zhǎng)cDNA文庫是通過在熱循環(huán)器中孵育GEMs制備的。將含有cDNA的GEMs破碎，并將所有單細(xì)胞cDNA文庫聚集在一起，用DynaBeads MyOne Silane beads通過聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，之后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)序文庫構(gòu)建，之后用Illumina Nextseq對(duì)最終構(gòu)建的單細(xì)胞文庫進(jìn)行測(cè)序。

 

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1）scRNAseq揭示小鼠腎臟先天免疫細(xì)胞聚類的不同

實(shí)驗(yàn)從腎臟中分離出除去淋巴細(xì)胞的免疫細(xì)胞群(CD45⁺)，并使用10x Genomics平臺(tái)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行scRNAseq分析(圖1A)。為了進(jìn)行這項(xiàng)分析，研究者使用熒光標(biāo)記抗體，排除了T細(xì)胞(小鼠和豬的CD3e，大鼠和人的CD3)和B細(xì)胞 (小鼠的B220，大鼠的CD45RA，人的CD19)。最終分別分析了來自小鼠、大鼠、豬和人腎臟組織的3013、3935、4671和2868個(gè)單細(xì)胞。使用無偏分級(jí)聚類和熱圖分析法顯示了每種物種獨(dú)特的內(nèi)免疫細(xì)胞圖譜，每種顏色代表不同的細(xì)胞群體(圖1B和1C)。

 

圖1、scRNAseq識(shí)別腎臟先天免疫中具有獨(dú)特基因表達(dá)模式的細(xì)胞群。(A)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖。(B)小鼠、大鼠、豬和人腎臟先天免疫細(xì)胞的tSNE圖和(C)熱圖。

 

為了理解先天免疫細(xì)胞的保護(hù)并確定這些細(xì)胞在不同物種間的標(biāo)記，研究者首先使用自已發(fā)表文獻(xiàn)和在線數(shù)據(jù)庫的先天免疫細(xì)胞群體的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記，從小鼠scRNAseq數(shù)據(jù)中分離細(xì)胞群體。使用指定的基因，通過tSNE圖和小提琴圖來識(shí)別小鼠腎中不同類型先天免疫細(xì)胞（圖2）。

 

圖2、經(jīng)典標(biāo)記可用于識(shí)別小鼠腎臟中不同的先天免疫細(xì)胞簇。tSNE投影和伴隨的小提琴圖描繪了用于鑒定(A)嗜中性粒細(xì)胞(Lcn2)，(B)自然殺傷細(xì)胞(Gzma)，(C)免疫球蛋白樣細(xì)胞(Il7r)，(D)免疫球蛋白樣細(xì)胞(Itgam，Ccr2)，(E)常駐巨噬細(xì)胞(Adgre1，Cd64)和(F)樹突狀細(xì)胞(Snx22，Batf3)的基因。

 

2）比較分析確定富集于常駐巨噬細(xì)胞新的基因

使用上面的標(biāo)記基因，研究者手工注釋tSNE圖中用于檢測(cè)小鼠腎臟中已知的先天免疫細(xì)胞群(圖3A)。結(jié)果強(qiáng)調(diào)了小鼠腎臟中嗜中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的不同簇的存在。為了鑒定小鼠腎臟先天免疫細(xì)胞的新標(biāo)記基因，研究者使用Seurat來鑒定圖3A中每個(gè)細(xì)胞群中存在的最高差異表達(dá)基因。用這種方法確定了一系列候選基因，它們的表達(dá)在小鼠的每一個(gè)先天免疫部分都很豐富，并且包括已知和未知的標(biāo)記(圖3B)。使用這種無偏方法，識(shí)別幾種特異性表達(dá)轉(zhuǎn)錄物，以及胚胎來源的常駐巨噬細(xì)胞(圖3C)。

 

 

圖3、scRNAseq可用于鑒定小鼠腎臟先天免疫細(xì)胞的新標(biāo)記。(A)根據(jù)圖2中確定的典型基因的表達(dá)，對(duì)小鼠腎臟的單細(xì)胞進(jìn)行人工注釋。(B)識(shí)別每個(gè)先天免疫細(xì)胞中新基因表達(dá)特征的熱圖。(C) 不同細(xì)胞中的新基因的tSNE和小提琴圖。

 

3) 使用Fluidigm C1序列驗(yàn)證10x Genomics數(shù)據(jù)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證10x Genomics尋找的新標(biāo)記物，本研究使用流式細(xì)胞儀根據(jù)常規(guī)標(biāo)記物對(duì)有限和常駐巨噬細(xì)胞群進(jìn)行分選，并使用Fluidigm C1技術(shù)進(jìn)行scRNAseq分析。C1數(shù)據(jù)的主成分分析圖、小提琴圖和熱圖分析表明，有限和常駐巨噬細(xì)胞表達(dá)獨(dú)特的基因特征，與10x Genomics相匹配(圖4A-C)。

 

 

圖4、Fluidigm C1 scRNAseq可在小鼠常駐巨噬細(xì)胞中檢測(cè)到DEGs。(A)主成分分析圖，(B)小提琴圖和(C)熱圖。

 

4) scRNAseq揭示物種間常駐巨噬細(xì)胞基因表達(dá)模式的保守性

接下來，研究者評(píng)估在從大鼠、豬和人腎臟分離的CD45⁺陰性先天免疫細(xì)胞中是否可以發(fā)現(xiàn)相似的基因表達(dá)模式。首先選擇用于明確識(shí)別小鼠中常駐巨噬細(xì)胞的最高差異表達(dá)基因 (C1qc)，并在每個(gè)物種的序列數(shù)據(jù)中尋找該基因的存在。值得注意的是，tSNE和小提琴圖顯示了在來自小鼠、大鼠、豬和人類組織的單細(xì)胞數(shù)據(jù)中富含C1qc表達(dá)的獨(dú)特細(xì)胞群的存在(圖5A)。為了測(cè)試候選常駐巨噬細(xì)胞基因表達(dá)模式是否存在于不同物種中，研究者搜索了在小鼠常駐巨噬細(xì)胞中富集的來自大鼠、豬和人腎組織的單細(xì)胞數(shù)據(jù)另外三種頂級(jí)差異表達(dá)基因(Cd81，Cd74，Apoe)。tSNE和小提琴圖顯示，每個(gè)基因在每個(gè)物種的一個(gè)共同細(xì)胞群中發(fā)現(xiàn)(圖5B-D)。這些數(shù)據(jù)表明候選常駐巨噬細(xì)胞基因表達(dá)模式可能在跨物種常駐巨噬細(xì)胞中保守。

 

圖5、scRNAseq數(shù)據(jù)識(shí)別了多種物種中獨(dú)特的細(xì)胞群，這些細(xì)胞群與小鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞具有相同的基因表達(dá)模式。

 

然后研究者人工將細(xì)胞分為嗜中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、常駐巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(圖6)。

 

 

圖6、scRNAseq識(shí)別不同的腎先天免疫細(xì)胞。(A)人工注釋的小鼠、大鼠、豬和人先天免疫區(qū)室的tSNE圖。(B)tSNE和小提琴圖，顯示了常用的人巨噬細(xì)胞標(biāo)志物(CD68、CD163、CD14、FCGR3A)在人腎組織的scRNAseq數(shù)據(jù)中的表達(dá)。

 

本研究使用scRNAseq數(shù)據(jù)來鑒定小鼠常駐巨噬細(xì)胞的新標(biāo)志物，這些標(biāo)志物可能存在于跨物種的候選常駐巨噬細(xì)胞上。為了證實(shí)鑒定的新標(biāo)記物富集在小鼠腎常駐巨噬細(xì)胞中，研究者對(duì)從野生型小鼠腎中獲得的單細(xì)胞進(jìn)行了分類，并尋找新的識(shí)別巨噬細(xì)胞標(biāo)記物(C1q，CD81，CD74，Apoe)的存在。作為對(duì)照，我們還分析了這些標(biāo)記在免疫巨噬細(xì)胞中的表達(dá)。流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析表明，與有限巨噬細(xì)胞相比，常駐巨噬細(xì)胞中表達(dá)C1q、CD81和CD74的細(xì)胞數(shù)量和平均熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(圖7)。

 

 

圖7、由scRNAseq鑒定的基因在蛋白質(zhì)水平上富集在小鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞中。

 

5）使用新標(biāo)記識(shí)別的常駐巨噬細(xì)胞與外周血的交換最少

為了確定使用新方法鑒定的候選常駐巨噬細(xì)胞缺乏與外周血的交換，這是組織常駐巨噬細(xì)胞的特征，研究者在CD45同源小鼠(CD45.2和CD45.1)中應(yīng)用了共生模型。我們的數(shù)據(jù)表明，使用新標(biāo)記物鑒定的候選常駐巨噬細(xì)胞嵌合率為2%-6%?？偟膩碚f，本研究數(shù)據(jù)證實(shí)，使用新標(biāo)記物確定為候選常駐巨噬細(xì)胞的細(xì)胞群被小鼠外周血細(xì)胞所替代的程度最低。

 

研究結(jié)論：

1、利用scRNAseq技術(shù)鑒定了小鼠腎常駐巨噬細(xì)胞中表達(dá)豐富的基因。

2、使用scRNAseq數(shù)據(jù)為這些候選腎常駐巨噬細(xì)胞確定了一組新的細(xì)胞表面標(biāo)記。

3、除小鼠外，在人、大鼠、豬等多種物種中鑒定了腎常駐巨噬細(xì)胞。

 

 

關(guān)于天昊

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