專屬含PCR抑制劑的環(huán)境樣本微生物拷貝數(shù)定量的最佳解決方案!

發(fā)稿時間：2019-06-04來源：天昊生物

腐植酸（Humic acid，HA）是動植物遺骸，主要是植物的遺骸，經(jīng)過微生物的分解和轉(zhuǎn)化，以及地球化學(xué)的一系列過程造成和積累起來的一類有機物質(zhì)。它的總量大得驚人，數(shù)以萬億噸計。江河湖海，土壤煤礦，大部分地表上都有它的蹤跡。由于它的廣泛存在，所以對地球的影響也很大，涉及到碳的循環(huán)、礦物遷移積累、土壤肥力、生態(tài)平衡等方面。

 目前很多學(xué)者使用qPCR對環(huán)境樣本（例如土壤，水體和淤泥）中的微生物數(shù)量進行絕對定量，但是研究發(fā)現(xiàn)腐殖酸廣泛地存在于以上環(huán)境樣本中，無論是基因組抽提前去除樣本中的腐殖酸還是在基因組抽提后去除基因組中殘留的腐殖酸都是很難將這些腐殖酸完全去除，這些殘留的腐殖酸會通過抑制酶的活性抑制PCR，從而影響qPCR結(jié)果的準確性, 最終影響樣品中微生物數(shù)量的定量結(jié)果。

基于此，本測試通過研究不同微生物定量方法（qPCR絕對定量技術(shù)和天昊生物微生物16S擴增子絕對定量測序技術(shù)）在有PCR抑制物（腐殖酸）存在的情況下，對樣本中微生物數(shù)量的定量準確性的影響。

實驗設(shè)計

1、 樣本：

• 類型1：將9種購買的標準菌株DNA按一定比例混合，標記為標準菌株DNA（S）
• 類型2：土壤樣本，標記為標準菌株DNA（T）

2、 PCR抑制劑：

• 添加不同濃度腐殖酸（HA）至反應(yīng)體系中， HA 終濃度分別為 0ng/ul、10ng/ul、30ng/ul、50ng/ul；

表1 樣本信息說明

3、 實驗設(shè)計：

•  添加不同濃度腐殖酸條件下進行qPCR絕對定量實驗，計算樣品的總細菌16S拷貝數(shù)；
• 添加不同濃度腐殖酸條件下進行微生物16S擴增子絕對定量測序?qū)嶒?，計算樣品的總細?6S拷貝數(shù)；

4、 實驗?zāi)康模?/span>

• 探究腐殖酸對qPCR檢測細菌拷貝數(shù)的影響；
• 通過比較兩種方法計算的樣品總細菌拷貝數(shù)結(jié)果，探究在PCR抑制物存在的情況下，兩種方法的適用性；

實驗結(jié)果

 腐殖酸對qPCR檢測細菌拷貝數(shù)的影響 

• 根據(jù)測試結(jié)果可知，腐殖酸對qPCR 反應(yīng)確實具有抑制作用，這與腐殖酸是一種 PCR 抑制劑的結(jié)論一致；
• 當 qPCR 反應(yīng)體系中腐殖酸終濃度為 50ng/ul 時，抑制作用非常明顯；
•  因此若環(huán)境樣本中含有高濃度腐殖酸時，qPCR 計算的樣本拷貝數(shù)將與真實值存在較大偏差。

圖 2  添加不同濃度腐殖酸條件下qPCR檢測標準菌株DNA和土壤DNA樣本的總細菌16S拷貝數(shù)

16S擴增子絕對定量測序和 qPCR檢測細菌拷貝數(shù)時腐殖酸的影響對比

• 通過qPCR技術(shù)，無論是標準菌株DNA或土壤DNA樣本，反應(yīng)體系中腐殖酸終濃度為50ng/ul時，與不加腐殖酸的對照組相比，得到的兩組數(shù)據(jù)結(jié)果具有明顯差異；
• 通過天昊生物16S擴增子絕對定量測序技術(shù)，反應(yīng)體系中腐殖酸終濃度為50ng/ul時，與不加腐殖酸的對照組相比，得到的兩組數(shù)據(jù)結(jié)果無顯著差異；
• 造成以上結(jié)果的原因是：qPCR進行細菌拷貝數(shù)定量時，構(gòu)建標準曲線的標準品不含有腐殖酸而樣本則含有腐殖酸，并且兩者在兩個樣本孔中分別進行各自的PCR反應(yīng)，所以PCR反應(yīng)效率不同，因此定量結(jié)果會有偏差。而天昊生物16S擴增子絕對定量測序技術(shù)進行細菌拷貝數(shù)定量時，構(gòu)建標準曲線的標準品和樣本DNA是在同一個樣本孔中一起進行PCR反應(yīng)，所以PCR反應(yīng)效率相同，因此校正了腐殖酸對PCR的影響，避免了腐殖酸等PCR抑制物對樣品細菌16S拷貝數(shù)定量的影響。

圖 3  16S擴增子絕對定量測序和qPCR檢測細菌拷貝數(shù)時腐殖酸的影響對比

實驗數(shù)據(jù)總結(jié)

• 綜合以上數(shù)據(jù)結(jié)果，當環(huán)境樣本中在有腐殖酸等PCR抑制物存在的情況下，天昊生物16S擴增子絕對定量測序技術(shù)計算得到的樣品細菌16S拷貝數(shù)更準確，更適用。
• 天昊生物16S擴增子絕對定量測序技術(shù)是針對含PCR抑制劑環(huán)境樣本中微生物拷貝數(shù)絕對定量的最佳解決方案。 

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