新年開(kāi)篇！天昊生物微生物項(xiàng)目文章登陸《Biology and Fertility of Soils》

發(fā)稿時(shí)間：2020-02-19來(lái)源：天昊生物

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)近期在土壤學(xué)領(lǐng)域一區(qū)雜志《Biology and Fertility of Soils》上發(fā)表了關(guān)于8年施氮對(duì)小麥根際細(xì)菌群落遺傳效應(yīng)的研究文章。在這項(xiàng)研究中天昊生物有幸承擔(dān)了樣品的相對(duì)定量擴(kuò)增子測(cè)序工作。在恭喜客戶發(fā)表文章同時(shí)，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目：Legacy effects of 8-year nitrogen inputs on bacterial assemblage in wheat rhizosphere中文題目：8年施氮對(duì)小麥根際細(xì)菌群落的遺傳效應(yīng)期刊名：Biology and Fertility of Soils影響因子：4.829

研究概要

本研究主要探討8年施氮（以0、140、280、470和660kg N ha?1 year?1為梯度）對(duì)小麥根際細(xì)菌群落多樣性、相互作用和組裝過(guò)程的影響。根際細(xì)菌α-多樣性隨歷史施氮量的增加而增加，但在施氮量超過(guò)280kg N ha?1 year?1時(shí)，根際細(xì)菌α-多樣性沒(méi)有變化。歷史施氮量明顯改變了根際細(xì)菌群落組成，施氮量大的土壤與不施氮的土壤差異較大。最接近相對(duì)指數(shù)（NRI）和最接近分類單元指數(shù)（NTI）分析表明，大多數(shù)樣品的根際細(xì)菌群落是系統(tǒng)聚類的，高氮處理（>470 kg N ha?1 year?1）比低氮處理（<140 kg N ha?1 year?1）表現(xiàn)出更高的聚類水平，表明歷史氮輸入越高，土壤環(huán)境選擇壓力越大。小麥地上生物量的增加伴隨著共生網(wǎng)絡(luò)規(guī)模和連接性的增大?？傮w而言，隨著歷史氮輸入的增加，所產(chǎn)生的遺留效應(yīng)迫使根際細(xì)菌群落承受更高的環(huán)境選擇壓力，并在隨后的作物生長(zhǎng)過(guò)程中間接影響小麥根際組合的復(fù)雜性。

研究背景

氮（N）肥是限制植物和微生物生長(zhǎng)的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，在全球范圍內(nèi)被供應(yīng)到陸地生態(tài)系統(tǒng)中，自工業(yè)革命以來(lái)，由于人類活動(dòng)的結(jié)果，氮的輸入率翻了一番。在我國(guó)集約農(nóng)業(yè)地區(qū)，相當(dāng)數(shù)量的氮（550-600 kg N ha?1 year?1）直接施入農(nóng)田土壤。氮素的富集會(huì)影響土壤微生物群落的組成和功能，隨著群落組成的變化，微生物多樣性和呼吸作用降低，主要受土壤pH、有機(jī)碳和總氮含量的變化驅(qū)動(dòng)。除了對(duì)土壤微生物的影響外，施氮還增加了與植物相關(guān)的凋落物C和根際沉積物C。由于長(zhǎng)期施用肥料而引起的土壤變化稱為遺留物或殘留物，即使停止施肥，也可能在隨后的季節(jié)產(chǎn)生持續(xù)效應(yīng)（稱為遺留效應(yīng)）。先前的研究表明，先前的植物作物類型和土地利用歷史對(duì)微生物群落組成和多樣性具有遺留影響，然而，目前還缺乏對(duì)長(zhǎng)期施氮對(duì)微生物多樣性影響的研究。根際是植物根系周圍的毫米級(jí)區(qū)域，是絕大多數(shù)活性微生物的棲息地，因此也是微生物相互作用的熱點(diǎn)。根際微生物以根系分泌物為食，被認(rèn)為是植物表型的一部分，在功能生態(tài)學(xué)中起著關(guān)鍵作用過(guò)程，如獲取植物養(yǎng)分，凋落物分解，保護(hù)土壤健康。研究發(fā)現(xiàn)植物的種類、基因型和發(fā)育階段可以改變根際微生物的群落組成和多樣性，從而影響土壤功能。此外，土壤鹽分和pH值等理化性質(zhì)的變化也會(huì)對(duì)根際微生物群落產(chǎn)生影響。因此，了解根際細(xì)菌群落對(duì)長(zhǎng)期施氮遺留效應(yīng)的響應(yīng)是非常重要的。

以前在研究根際群落時(shí)，主要采用了基于分類單元和功能的方法，然而，細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育可能提供更多關(guān)于基于性狀的群落組裝的信息，群落組裝過(guò)程包括確定性過(guò)程（例如，系統(tǒng)發(fā)育聚類和系統(tǒng)發(fā)育過(guò)度擴(kuò)散）和隨機(jī)過(guò)程（例如，概率擴(kuò)散和生態(tài)漂移）。環(huán)境過(guò)濾會(huì)導(dǎo)致物種的親緣關(guān)系比預(yù)期的更為密切（系統(tǒng)發(fā)育聚類），而競(jìng)爭(zhēng)性排斥則會(huì)導(dǎo)致親緣關(guān)系不太密切的物種（系統(tǒng)發(fā)育過(guò)度分散）。一些研究表明，在細(xì)菌群落中，確定性過(guò)程占主導(dǎo)地位，隨著海拔、鹽度梯度、極端酸性或堿性條件的增加，系統(tǒng)發(fā)育聚類增加，觀察到的群落聚集模式也取決于它們是在大空間尺度上進(jìn)行檢查還是在精細(xì)空間尺度上進(jìn)行檢查。目前，韋伯等人提出了基于零模型的群落組合系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu)分析方法，即觀察到的平均成對(duì)系統(tǒng)發(fā)育距離（MPD）和平均最近分類單元距離（MNTD）分別與零模型期望值進(jìn)行比較，這種方法為識(shí)別群落組裝過(guò)程提供了一種很有前途的選擇。

微生物群落組裝的生態(tài)過(guò)程不僅包括環(huán)境因素引起的系統(tǒng)發(fā)育群落結(jié)構(gòu)的變化，還包括微生物間的相互作用。這些關(guān)系可以包括積極的（如互惠）、消極的（如競(jìng)爭(zhēng)）和中立的關(guān)系。微生物之間的相互作用對(duì)土壤養(yǎng)分循環(huán)和作物健康具有潛在的影響。共生網(wǎng)絡(luò)分析為探索微生物間相互作用對(duì)環(huán)境的響應(yīng)提供了有力的工具。同時(shí)，網(wǎng)絡(luò)分析可以用來(lái)識(shí)別支持微生物群落功能和穩(wěn)定性的關(guān)鍵物種；例如，在底土中，一些關(guān)鍵屬的消失可能導(dǎo)致群落破碎。因此，通過(guò)共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析研究微生物的相互作用，有助于了解不同環(huán)境下群落聚集的基本原理，識(shí)別群落中可能存在的關(guān)鍵類群。

土壤取樣與試驗(yàn)設(shè)計(jì)：

在中期定位試驗(yàn)場(chǎng)，以冬小麥、夏水稻的輪作為主，采集了不同施氮量的土壤，從2010年開(kāi)始實(shí)施現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)：3個(gè)重復(fù)，5個(gè)氮肥處理，歷史施氮8年，每年施氮量分別為：0、140、280、470、660 kg N ha?1（以下分別為N0、N140、N280、N470、N660），栽培冬小麥和夏水稻。在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，尿素供氮，過(guò)磷酸鈣供磷，氯化鉀供鉀。2017年小麥開(kāi)花期，采用固體細(xì)溝采樣器（內(nèi)徑3cm）和隨機(jī)取樣方法，從每個(gè)處理區(qū)0-20cm土層中采集土壤5kg，風(fēng)干土樣用不銹鋼網(wǎng)（<5mm）過(guò)篩，每種氮處理的土樣分別用聚乙烯袋充分混合。盆栽試驗(yàn)前測(cè)定了各處理的土壤理化性質(zhì)。

將土壤填入聚丙烯盆中（高度×直徑，10 cm×12 cm），土壤約500 g干重，進(jìn)行了16個(gè)重復(fù)的微觀實(shí)驗(yàn)，以盡量減少重復(fù)之間的變異性，本研究共安排80盆（5次施氮量×16次重復(fù)）。將盆栽置于玻璃溫室中，每天12小時(shí)，平均氣溫25°C，在盆上播種小麥，每天用自來(lái)水澆水，保持土壤水分在20%左右。為了消除肥料對(duì)土壤微生物和植物的干擾，研究歷史氮素輸入對(duì)土壤微生物和植物的遺傳效應(yīng)，在整個(gè)植物生長(zhǎng)期不施肥。

16S擴(kuò)增子相對(duì)定量測(cè)序：

在開(kāi)花期（移栽后8周生長(zhǎng)），收集80個(gè)盆栽植物，對(duì)根際土壤進(jìn)行采樣。根際土壤樣品的采集方法是將包括根在內(nèi)的整個(gè)小麥植株從土壤中移開(kāi)，通過(guò)抱枝的方式進(jìn)行劇烈搖動(dòng)，并將殘留在根表面的土壤視為根際土壤。包括根際土壤的根系立即從植株上切下，轉(zhuǎn)移到含有10毫升無(wú)菌水的無(wú)菌離心管中。附著在根表面的土壤通過(guò)渦旋和振蕩混合到水中，然后除去根，將裝有懸浮液的管子渦旋5分鐘，11000g離心約5 min，棄上清液，剩余根際土壤部分保存于-20℃，48 h內(nèi)提取DNA。使用MoBio Powersoil DNA Isolation Kits提取根際土壤DNA，然后進(jìn)行16S擴(kuò)增子相對(duì)定量測(cè)序（V4-V5區(qū)域）。

植物和土壤性質(zhì)檢測(cè)：

將地上植物和根樣品在75℃下烘干，直到獲得用于生物量測(cè)量的恒定重量。土壤樣品經(jīng)風(fēng)干和篩分進(jìn)行化學(xué)分析，例如測(cè)定土壤pH值、有效磷（AP）、有效鉀（AK）、有機(jī)碳（SOC），總氮（TN）、堿解氮(Alk-N)等指標(biāo)。

研究結(jié)果

植物生物量與土壤特性

盆栽試驗(yàn)前，N0處理與其它施氮處理的土壤化學(xué)性質(zhì)存在顯著差異。N0處理土壤AP、AK含量及pH值均顯著高于其它4個(gè)施氮處理。長(zhǎng)期施氮與不施氮相比，提高了土壤NO3-–N和TN含量。盆栽試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各處理間土壤理化性質(zhì)的差異保持不變（表1）。與其它氮肥處理相比，N0處理的土壤化學(xué)性質(zhì)和植物生物量均表現(xiàn)出顯著差異（表1）。土壤pH值在N0時(shí)表現(xiàn)出最大值（pH＝7.47），N660為最低值（pH＝7.25）。四種施氮處理的土壤有機(jī)碳SOC和全氮TN含量均高于N0處理。長(zhǎng)期施氮增加了土壤Alk-N濃度（從102.13到122.04），顯著降低了土壤有效磷AP（從57.14到38.33）和有效鉀AK（從90.98至64.17）。施氮處理植株總生物量顯著高于N0處理，但施氮處理間差異不顯著。N140、N470和N660處理的地上生物量顯著高于N0處理。雖然不同處理間的根系生物量存在顯著差異，但沒(méi)有觀察到一致的趨勢(shì)。

表1種植末期各處理土壤理化性質(zhì)及植物生物量

遺傳效應(yīng)驅(qū)動(dòng)小麥根際細(xì)菌群落的多樣性和差異性

根際細(xì)菌Chao1、Shannon和觀測(cè)豐富度指數(shù)與歷史施氮量顯著相關(guān)（圖1）。低氮處理（N0和N140）的樣品多樣性顯著低于高氮處理（N280、N470和N660）。根據(jù)擬合模型，Chao1指數(shù)、Shannon多樣性和觀測(cè)豐富度隨施氮量的增加呈非線性增加（圖1）。

圖1根際土壤細(xì)菌α-多樣性在N輸入梯度上的變化，包括Chao1指數(shù)（a）、Shannon多樣性（b）和觀測(cè)豐富度（c）。

為了評(píng)估根際細(xì)菌群落的差異（β-多樣性），使用基于Bray-Curtis和加權(quán)UniFrac距離的度量來(lái)評(píng)估群落組成。NMDS圖顯示根際細(xì)菌群落在不同施氮量下有明顯的聚集性（圖2）。同時(shí)，MRPP、ANOSIM和ADONIS試驗(yàn)表明，所有處理之間的群落組成存在差異。所有樣本的差異配對(duì)比較表明，隨著氮輸入的絕對(duì)差異，細(xì)菌群落組成（Bray-Curtis距離）和系統(tǒng)發(fā)育（加權(quán)UniFrac）距離的差異顯著增加，然而，組內(nèi)差異沒(méi)有顯著變化。

圖2 基于Bray-Curtis距離（a）和加權(quán)均勻度（b）的NMDS分析顯示處理間土壤根際細(xì)菌群落組成的變化?；诩?xì)菌距離矩陣的組間MRPP差異檢測(cè)。

遺傳效應(yīng)驅(qū)動(dòng)小麥根際細(xì)菌群落組成與功能

為了評(píng)價(jià)根際細(xì)菌群落組成，對(duì)30個(gè)門進(jìn)行了高質(zhì)量序列分析，屬于15個(gè)最豐富門（相對(duì)豐度>1%）的細(xì)菌占所有序列的83.8%，其中變形菌門占從每個(gè)樣本獲得的細(xì)菌總序列的29.5-48.1%?；谙鄬?duì)豐度和觀測(cè)到的OTU的數(shù)量，在所有土壤樣品中檢測(cè)到優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌群（變形桿菌、擬桿菌、嗜酸細(xì)菌、氯磷菌、厚壁菌和放線菌），但它們的相對(duì)豐度變化顯著。然而，在門的水平上，隨著氮的添加，觀察到兩種不同的相對(duì)豐度模式，隨著氮輸入速率的增加，Deltaproteobacteria的相對(duì)豐度不斷增加，而Verrucomicrobia的相對(duì)豐度則相反。在低氮條件下（小于280 kg N ha?1 year?1），某些菌的相對(duì)豐度顯著降低或增加，但當(dāng)?shù)练e速率超過(guò)280kg N ha?1 year?1時(shí)，這些菌則沒(méi)有變化，例如Gammaproteobacteria, Bacteroidetes, Acidobacteria, Chloroflexi, Gemmatimonadetes，其它細(xì)菌在氮梯度上沒(méi)有顯示出一致的趨勢(shì)。此外，還確定了不同處理間顯著差異的優(yōu)勢(shì)屬（相對(duì)豐度>1%）。然而，氮處理下優(yōu)勢(shì)屬的變化并不總是在門水平上表現(xiàn)出來(lái)，例如，屬于Alphaproteobacteria亞門的Rhodobacter和屬于Firmicutes的Bacillus的變化并沒(méi)有分別導(dǎo)致Alphaproteobacteria和Firmicutes的一致變化。歷史高氮增加了Gemmatimonas, Gp4, Gp6, Gp7的比例，而降低了Ohtaekwangia, Rhodobacter, Pseudoxanthomonas的比例。

FAPROTAX工具用于將細(xì)菌分支（如屬或種）映射到代謝和生態(tài)相關(guān)功能，本研究中的細(xì)菌可被分配到66個(gè)功能群。在預(yù)測(cè)的功能組中，33個(gè)與C、N和S循環(huán)相關(guān)的主要功能組被歷史氮輸入顯著改變。歷史高氮輸入與低氮相比，遺留效應(yīng)導(dǎo)致了與氫營(yíng)養(yǎng)甲烷化、甲烷化、好氧氨氧化、好氧亞硝酸鹽氧化、硝化作用、硫代硫酸鹽呼吸和暗硫化物氧化相關(guān)的功能群的相對(duì)豐度較高。在高氮處理（N280、N470和N660）中，與纖維素分解、甲醇氧化、硝酸鹽還原有關(guān)的功能群的相對(duì)豐度均顯著低于N0和N140處理。此外，N0處理中甲殼分解功能群的相對(duì)豐度最大。

氮梯度下根際細(xì)菌群落的NRI和NTI

根據(jù)零模型分析，與高氮處理（超過(guò)280 kg N ha?1 year?1）相關(guān)的最接近相對(duì)指數(shù)（NRI）和最接近分類單元指數(shù)（NTI）顯著大于零（圖3）。這表明高氮施用的遺留效應(yīng)使物種間的親緣關(guān)系比預(yù)期的更為密切。NTI值顯著大于零與低氮處理（小于280 280 kg N ha?1 year?1）相關(guān)（圖3b），而低氮樣品中細(xì)菌群落的NRI值與零無(wú)顯著差異（圖3a）。這些結(jié)果表明，低氮處理根際細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育聚類集中在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的末端，而群落組成的隨機(jī)系統(tǒng)發(fā)育模式則發(fā)生在較高層次的樹(shù)節(jié)點(diǎn)。

圖3土壤中根際細(xì)菌群落的最接近相對(duì)指數(shù)（NRI）（a）和最接近分類單元指數(shù)（NTI）（b）隨氮梯度的變化而變化。正的NRI和NTI值表明群落中的物種比預(yù)期的更接近。星號(hào)表示NRI（或NTI）值與顯著性水平之間的顯著差異

氮梯度上根際細(xì)菌群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)

采用共生網(wǎng)絡(luò)分析方法，研究了小麥根際細(xì)菌間潛在的相互作用和生態(tài)位共享。為了進(jìn)行這一分析，我們基于5個(gè)施氮梯度土壤中的序列數(shù)據(jù)，在屬（和OTU）水平的根際細(xì)菌分類群之間構(gòu)建了5個(gè)細(xì)菌共生網(wǎng)絡(luò)。共生網(wǎng)絡(luò)圖顯示了不同處理間的巨大差異（圖4a-e）。根際網(wǎng)絡(luò)中基于屬水平的節(jié)點(diǎn)數(shù)和連接數(shù)在N梯度上是可變的，最小值出現(xiàn)在N0處理中（即，節(jié)點(diǎn)數(shù)從N0的92到N660的193，連接數(shù)從N0的100到N140的1184）（表2，圖4）。根際網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)隨地上生物量的增加而單調(diào)增加（圖4f）。與高地上生物量相關(guān)的根際網(wǎng)絡(luò)比與低地上生物量相關(guān)的根際網(wǎng)絡(luò)包含更多的連接，這表明高地上生物量產(chǎn)生更復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)模式（連接數(shù)量，從100到1184）（圖4a-f）。此外，在OUT水平，共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)和連接的變化與屬水平網(wǎng)絡(luò)的變化趨勢(shì)相似。綜上所述，隨著土壤肥力的增加，根際細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)隨著地上生物量的增加逐漸變得復(fù)雜。

此外，BC反映了一個(gè)特定節(jié)點(diǎn)對(duì)網(wǎng)絡(luò)中其他節(jié)點(diǎn)交互作用的控制程度，BC得分高的屬對(duì)維持微生物網(wǎng)絡(luò)的連通性有很強(qiáng)的影響。與高地上生物量相關(guān)的根際網(wǎng)絡(luò)中大多數(shù)節(jié)點(diǎn)的BC比與低地上生物量相關(guān)的根際網(wǎng)絡(luò)中的BC強(qiáng)得多，并且隨著地上生物量的增加，強(qiáng)節(jié)點(diǎn)的數(shù)量逐漸增加（圖4f）。觀察到的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的BC分布表明，與高地上生物量（N140、N470和N660）相關(guān)的多個(gè)節(jié)點(diǎn)（例如：Caulobacter, Rhodobacter, Ignavibacterium, Nitrospira）承擔(dān)了關(guān)鍵的網(wǎng)絡(luò)作用，而一些節(jié)點(diǎn)（例如：Sporomusa, Clostridium_III, Bacillus, Tumebacillus, Geobacter）的BC值較低，與地上生物量（N0，N280）相關(guān)。細(xì)菌群落經(jīng)過(guò)重新排列，在確定整個(gè)網(wǎng)絡(luò)組成方面賦予了幾個(gè)屬以關(guān)鍵作用。在與高地上生物量相關(guān)的根際共生網(wǎng)絡(luò)中，很大一部分節(jié)點(diǎn)定義了網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，表明更多的屬形成了細(xì)菌群落相互作用的模式。

圖4各處理根際細(xì)菌群落基于屬水平的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析（a-e）。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)菌系統(tǒng)類型。每個(gè)節(jié)點(diǎn)的大小與中間中心度的個(gè)數(shù)成正比。節(jié)點(diǎn)間的中間中心度和網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性（節(jié)點(diǎn)和連接的數(shù)量）隨地上生物量（f）的變化。

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